Çeşitli hastalıklara yönelik tedavi stratejilerinin oluşturulabilmesi için, öncelikle hastalığa neden olan mekanizmaların araştırılması ve ilaçların laboratuvar ortamında denenmesi gerekir. Bu nedenle, klinik denemelerden önce laboratuvar ortamında ilgili hücre ve dokular üzerinde deney yapılmasına ihtiyaç vardır. Bu konuda in vitro (laboratuvar ortamı) hücre kültürü, hücresel süreçleri incelemeyi sağlaması ve hayvan deneyleri için bir ön deney olması açısından önemlidir. Aynı tip hücrelerden oluşan bir popülasyon için inceleme yapılırken, hücrelerin temel yapısının korunduğu üç boyutlu bir sistemde beyin hücrelerinin fonksiyonlarının incelenmesine ihtiyaç vardır. Bu nedenle organotipik beyin parçası kültürünün, laboratuvar ortamında beyindeki moleküler ve hücresel süreçlerin araştırılmasında başarılı bir araç olduğu kanıtlanmıştır.
in vitro hücre kültürü, aynı tipte olan hücrelerin izole edilmiş bir ortamda incelenmesi için uygun bir yöntemdir. Bu nedenle, sinirbilimciler tarafından, nöronların, oligodendrositlerin ya da astrositlerin kültüre edilmesi için kullanılmıştır. Ayrıca bu yöntem hayvan deneylerinin sayısının da azalmasını sağlamıştır. Bu tip kültürün diğer faydaları nelerdir? Primer in vitro hücre kültürü, toksik maddelerin ve koruyucu kimyasalların etkisinin araştırılmasına olanak vermesinin yanında, hücrelerin hayatta kalımının, morfolojisinin ve fonksiyonunun da çalışılmasına olanak tanır. Ancak, izole edilmiş hücreler, diğer hücre tipleriyle etkileşimini kaybettiği için organizmanın doğasını tam olarak yansıtmaz. Bu nedenle, geçtiğimiz on yılda organotipik kültürün kullanılmasıyla, in vivo koşulları taklit etme imkanı ortaya çıkmıştır. Organotipik kültürler, dokudaki organizasyonların korunmasını sağlar. Bu özellikleri sayesinde bu yöntem, Alzheimer ve Parkinson hastalıklarını modellemek için kullanılmıştır.
Organotipik terimi, ilk defa 1954 yılında bir raporda yayınlanmıştır. Bu raporda, tavuk embriyosunda gözün farklılaşmasından bahsedilmiştir. İlk teknik tanım, 1971 yılında yapılan bir çalışmada oluşturulmuştur. Bu çalışmada, bir dokunun büyük bir kısmı odacık içerisinde organotipik bir kültür modelinde büyütülmüştür. Daha sonra bu odacık, doku plakası olarak modifiye edilmiştir. Daha sonra, bu alandaki en büyük gelişme roller tube tekniğinin kullanılmasıyla meydana gelmiştir. Bu yöntem de modifiye edildikten sonra, organotipik beyin kültürleri yarı geçirgen zarlarda yapıldı. Buna alternatif olarak da in oculo model geliştirildi ve anterior eye chamber denilen araçta üç boyutlu doku kültüre edilir.
Organotipik Doku Kültüründe Membran Tekniğinin Kullanımı
Hayvanlar kesildikten hemen sonra kafaları %70 etanolün içine koyulur ve beyinleri parçalara ayrılır. Beyinler, dokuyu kesen bir alet olan vibratoma yapıştırılır. Aseptip koşullarda, 100-400 mikrometre kalınlığındaki beyin parçaları, steril bir besiyerinde kültüre edilir. Organotipik parçalar, 6 kuyucuklu bir plakaya yerleştirilmiş 0,4 mikrometre kalınlığındaki membranların üzerine dikkatlice yerleştirilir. Beyin parçaları 37 derecede ve %5 karbodioksit içeren ortamda en az iki hafta kültüre edilir. Bu süre içerisinde besiyerleri, haftada bir ya da iki kere değiştirilir. Özel bir tipte olan nöronların hayatta kalması için, parçalar büyüme faktörü içeren ya da içermeyen besiyerleriyle desteklenebilir. Deneyin sonunda, parçalar %4 PAF ya da 10mM PBS içerisinde 4 derecede 3 saat tutulur ve sonra kullanılana kadar 4 derecede PBS içerisinde tutulabilir. Alternatif olarak beyin parçaları, membran üzerinde kültüre edilmeye devam edilebilir.
Beyin parçaları ile deney yapılırken iki tane soru ortaya çıkar. Analiz ne zaman yapılır? Genellikle, parçalar hayvandan beyin çıkarıldıktan hemen sonra ya da kültüre edildikten sonra çalışılır. Akut parça deneylerinin analiz edilmesinin avantajı, in vivo koşullara daha yakın özellik göstermesidir. Bu deneyler için, parçalar kültüre edilmez ve içerde salınan toksik moleküller deney başlamadan önce yıkanarak uzaklaştırılır. Bu aşamadan sonra genellikle elektrofizyolojik deneyler yapılır. Fakat organotipik beyin parçalarının kültürü için, 10 ile 14 gün arasında kültüre edilmelidir. Çünkü böylece, içsel olarak salgıladığı kalsiyuma ya da glutamata karşı tepki verme ihtimali azalır.
Organotipik Beyin Parçalarının Uygulamaları
Organotipik kültürler çok sayıda farklı hücre tipini çalışma olanağı sunar. Elekrofizyolojik deneylerden, gen transfer teknikleri ve görüntüleme tekniklerine kadar çok sayıda işlem için kullanılır. Ayrıca, parçalar bağlı bulundukları membrandan alındıktan sonra, genlerin aktivitesinin incelenmesi için ELISA, RT-PCR, HPLC gibi analiz yöntemleri uygulanır.
Bir maddenin ya da ilacın beyine zarar verip vermediğini görebilmek için de organotipik kültürler kullanılır. Bunun için ilgili madde kültüre verilir ve etkileri gözlemlenir. Bu işlemlere nörotoksisite testleri denir.
Korteks, ön beyin hipotalamus, talamus gibi birkaç beyin bölgesi bu şekilde kültüre edilebilir. Bu konuda akla gelen soru organotipik kültürün canlının koşullarına ne kadar yakın olduğudur. Bu yöntem de, hayvan deneylerinin yerine geçebilecek yeterlilikte olmadığı için, bulun sonuçların doğrulanması için sonraki aşamalarda, hayvan deneylerine, postmortem insan materyallerinde yapılan denemelere ve klinik denemelere ihtiyaç duyulur. Günümüzde bu yöntem; Alzheimer, Parkinson, multiple skleroz gibi nörodejeneratif hastalıklara yönelik deneysel çalışmalarda kullanılmaktadır.
Kaynakça:
Humpel. NEUROSCIENCE FOREFRONT REVIEW
ORGANOTYPIC BRAIN SLICE CULTURES: A REVIEW. Neuroscience 305 (2015) 8698
Yazar: Ayça Olcay