Geçtiğimiz yıllarda DNA dizileme teknolojisinin kullanım alanları artmıştır. Ana kullanım alanları; genomun birleştirilmesi, bireysel genomun yeniden dizilenmesi, klinikte dizileme ve dizileyicilerin moleküler sayım cihazlarına dönüştürülmesidir.
Genomun Birleştirilmesi
Genomun tamamı oldukça uzun bir DNA dizisidir. Bu nedenle genom dizilenirken tek seferde baştan uca dizilenmesi mümkün değildir. Bu nedenle genom nükleaz enzimleri aracılığıyla daha küçük parçalara ayrılır. Her bir parçanın dizisi çıkarılır. Dizisi bilinen parçaların bir yapboz gibi uygun şekilde birleştirilmesiyle tüm genomun dizisi elde edilir. İşte bu işelem genomun birleştirilmesi denir. Günümüzden 25 yıl önce, genom dizileme teknolojilerinin asıl amacı genomun bir kısmının ya da tamamının dizisinin elde edilmesiydi. 1977 yılında Sanger dizilemenin ortaya çıkmasıyla, genom ilk defa insan eliyle birleştirildi. Eğer DNA dizisi rastgele olsaydı, büyük genomlar keyfi olarak, sadece DNA parçalarındaki örtüşen noktalara göre kurulabilirdi. Fakat DNA dizisi rastgele değildir. DNA’da bulunan birbirini tekrar eden dizilerin ve teknik zorlukların kombinasyonu, büyük boyuttaki genomların kaliteli bir şekilde birleştirilmesini imkansız hale getiriyor. Bu nedenle, birleştirme için parçalardaki uyuşan dizilere ek bir ortak noktaya ihtiyaç vardır.
İnsan genom projesi için bu ek yakınlık bilgisi şu şekilde sağlanmıştır: 1) Aile ağacı yoluyla genetik polimorfizmlerin (DNA dizisindeki çeşitlilikler) dağılışına dayalı genetik haritalar ile bilgi edinilmiştir. 2) Genomun restriksiyon enzimleriyle parçalanması sonucu elde edilen parçaların durumuna göre genom birleştirilmiştir. 3) 1990 yılında Ansorge tarafından geliştirilen bir teknik ile de, uzunluğu bilinen DNA parçalarının uçları dizilenmiştir ve diğer parçalarla karşılaştırılmıştır. Klonlama yöntemine bağlı olarak uzunluk, birkaç bin baz ile birkaç milyonlarca baz arasında değişebilir. Bu yöntemler ile dizilemedeki hata 100,000 bazda 1 baza iner.
Genom dizilenirken, DNA parçalarının birleştirilmesi için bazı bilgisayar algoritmaları kullanılmaya başlandı. Bu konuda önemli gelişmelerden biri phrap ve TIGR assembler gibi algoritmalardan sonra Celera assembler’s graph-based approach (overlaplayoutconsensus) algoritmasının geliştirilmesidir. Celera ile birlikte, İnsan Genom Projesi’nde yüksek kalitede bir referans genom ortaya çıkarılmıştır. Referans bir genomun elde edilmesi, genom birleştirme işlemlerinde kıyaslanacak bir genomun kullanılmasına olanak tanır. Günümüzdeki dizileme için kullanılan insan referans genomu, 2004 yılında elde edilen diziden türevlenmiştir. Bu referans genom, Genome Reference Consortium’un çalışmasıyla geliştirilmiştir. Aynı kurum, referans genom konusunda düzenli güncellemeler yayınlanmaktadır.
Genom Yeniden Dizileme
İnsan genom projesinden sonraki aşama, genetik varyasyonların (DNA’da kişiden kişiye farklılık gösteren bölgeler) insanlar arasında kataloglanması yani yeniden dizilemedir. İnsanlardaki genetik varyasyonların belirlenmesi ise, genetik hastalıkların mekanizmasının anlaşılması, tanı ve tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi açısından oldukça önemlidir.
Yeniden dizilemede okunan kısımların genetik varyantlarının belirlenmesi için, referans genom ile kıyaslanması demektir. Bu işlem, genomun birleştirilmesinden oldukça farklıdır. Bowtie and BurrowsWheeler Aligner (BWA) gibi yeni algoritmalar milyonlarca okumanın (DNA parçalarının dizilenmesi) referans genoma göre haritalanmasını sağlar.
İnsan genom projesindeki insan genomu mozaik DNA donörlerinden oluşturuldu. Çoğunlukla Eşit şekilde Avrupa ve Afrika kökenine sahip ve New York’ta yaşayan bir kişilerden alınmıştır. 2007 yılında ise tüm genomu dizilenmiş ilk kişi Craig Venter’dir. Bunun ardından, 2008’de Jim Watson’ın genomu dizilenmiştir. Tüm genom dizileme bu esnada oldukça pahalıydı ve yapılan çalışmaların sonucunda genomun sadece %1-2’sinin protein kodladığı ortaya çıktı.
Tüm genom dizilemesinin 1000 amerikan dolarına düşürülmesi ve tüm ekzon (genomda protein kodlayan kısımlar) dizilemenin birkaç yüz dolara düşürülmesi insan genom dizileme uygulamalarını hızlandırmıştır. Ekzon dizileme projesiyle 2013 yılında 6,500 ekson dizilenmiştir.
Dizilemenin Klinik Uygulamaları
Son yıllarda insan genom dizileme ve insanlardaki varyasyonların yorumlanma teknolojileri hızla gelişmiştir. DNA dizilemenin klinik uygulama alanlarından biri, invazif olmayan prenatal testlerdir. 2008 yılında yapılan bir çalışmada, fetüsün DNA’sı annenin dolaşım sisteminde tespit edilmiştir ve bu yolla fetüsteki kromozom anormalliği saptanmıştır. Tarama testleri bu stratejiye hızlı bir şekilde adapte edilmiştir. Bu stratejiyle yapılan testler ile, anne adayları fetüste genetik bir anormallik olup olmadığını öğrenebilmektedir. Şimdiye kadar, dünya üzerinde birkaç milyon hamile kadın bu testi yaptırmıştır.
Tüm ekson dizilemenin (WES) en erken uygulaması, hastalıklarda yeni genlerin keşfedilmesi ve tanı yöntemlerinin geliştirilmesidir. Bu keşifleri, sinirsel gelişim ile ilgili hastalıklarda kodlama yapan dizide ortaya çıkan mutasyonların keşfedilmesi izlemiştir. WES artan şekilde tüm dünyada kalıtsal hastalıklar için tanı yöntemi olarak kullanılır.
Bir genom hastalığı olan kansere yönelik anlayışımız da, DNA dizileme teknolojisiyle gittikçe değişti. Büyük ölçekte yapılan yeniden dizileme ile, kanserin büyük oranda genetik heterojenlik (farklı genler ve mutasyonlarla bağlantı göstermesi) gösterdiği ortaya çıktı. DNA dizileme klinik kanser tedavilerini çeşitli şekillerde etkilemiştir. Bu teknoloji ile birlikte, her bir kanser çeşidindeki mutasyonu hedefleyen terapiler geliştirilmektedir. Ayrıca kanser tanısı için, biyopsi gibi invazif yöntemler yerine invazif olmayan tanı yöntemlerine, tümörden salınan hücrelerin ve serbest DNA’nın kandan elde edilmesiyle dizileme yapılarak tanı koyulmasına olanak verir. Bunlara ek olarak, kansere neden olan mutasyonun sonucunda ortaya çıkan yapısı bozulmuş proteinler antijen olarak kullanılır. Bu sayede, ilgili kanser türüne özel, özgül bir kanser aşısı geliştirilebilir.
Molekül Sayıcı Cihazlar Olarak Dizileyiciler
Genlerin aktivitesinin belirlemek için ürettikleri RNA ve protein miktarına bakmak gerekir. Dizileme teknolojisinin gelişmesiyle, RNA miktarı bu yolla tespit edilebilir. Fakat RNA üzerinde işlem yapılması için DNA’ya kıyasla daha hassas olduğu için, özel bir enzim ile cDNA’ya dönüştürülür. cDNA’ların uç kısımları dizilenir ve bir etiket gibi veri tabanlarına kayıt edilir. Bu şekilde cDNA’ların dizilenmesiyle genlerden RNA üretilmesinin profili çıkarılır. Bu işleme RNA dizileme denir. Bu yöntem de genetik hastalıkların varlığında, gen aktivitesindeki değişimi araştırabilmemizi sağlar.
Klinik uygulamaların yanında, çevrede ve insan vücudunda bulunan bakterilerin de DNA’sı dizilenmeye başlamıştır. Böylece metagenom adlı yeni bir alan ortaya çıkmıştır.
Popülasyon Ölçekli Dizileme
Şimdiye kadar yaşayan insan popülasyonunun %0,1’inin genomu dizilenmiştir. Buna ek olarak, insanların atalarının ve eski yıllarda yaşamış diğer insanlarla akraba olan türlerin genomlarının dizilenmesi, insanların tarihine de ışık tutacaktır. Ayrıca dizileme adli tıp alanında da kullanılmaktadır. Örneğin; bir kişinin kan ya da harhangi bir vücut sıvısı örneğinden DNA dizilemesi yapılarak, örneğin kime ait olduğu bulunabilir.
Gelişimsel Biyoloji
Her birimiz tek bir hücreden kökenlenen trilyonlarca hücreden meydana gelmekteyiz. Buna rağmen, gelişim ile ilgili anlayışımız yüzeyseldir. Fakat, genom dizileme ve genom manipülasyon teknolojilerinin gelişmesi, bu konuda daha fazla bilgiye ulaşmamızı sağlar. Örneğin; canlının farklı gelişim evrelerinde, hücrelerin sentezlediği RNA’lar ve proteinler arasındaki farklılıklar ve farklı hücre tiplerinin birbirleriyle etkileşimleri tespit edilebilir.
Dizileme teknolojileri, bilimlerden adli tıp alanına kadar oldukça geniş bir uygulama alanına sahiptir. Özellikle, sağlık alanında genetik hastalıkların mekanizmasının anlaşılması, tanı ve tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi konularında vazgeçilmez bir teknoloji olmuştur. Gelecekte, bu teknolojinin kullanılacağı yeni alanların ortaya çıkması ve daha fazla yaygınlaşması da mümkündür.
Kaynakça:
1) Shendure ve ark. DNA sequencing at 40: past, present
and future. doi:10.1038/nature24286.
Yazar: Ayça Olcay