Geleneksel taramalı elektron mikroskobu, bir numunenin yüzeyinden sekonder elektronların emisyonuna bağlıdır. Yüksek odak derinliği nedeniyle, taramalı elektron mikroskobu, stereo ışık mikroskobunun EM analogudur. TEM ile mümkün olmayan hücrelerin ve tüm organizmaların yüzeylerinin detaylı görüntülerini sağlamaktadır. Aynı zamanda partikül sayımı, boyut belirleme ve proses kontrolü için de kullanılabilmektedir. Taramalı elektron mikroskobu olarak adlandırılmaktadır çünkü görüntü, odaklanmış bir elektron ışınının bir tarama modelinde numunenin yüzeyine taranmasıyla oluşturulmaktadır. Birincil elektron ışınının yüzeye yakın atomlarla etkileşimi, rasterdeki her noktada parçacıkların emisyonuna neden olmaktadır örneğin, düşük enerjili ikincil elektronlar, yüksek enerjili geri saçılım elektronları, X ışınları ve hatta fotonlar. Bunlar, çeşitli detektörlerle toplanabilmektedir ve bunların ilgili sayıları, bir katot ışın tüpü üzerindeki her eşdeğer noktada parlaklığa çevrilebilmektedir.
Mikroskopta Boyut
Elektron mikroskopları, hücreler, biyopsiler, mikroorganizmalar, büyük moleküller ve daha fazlası gibi sayısız biyolojik numunenin alt yapısını incelemek için uzun zamandır kullanılmaktadır. Yeteneklerini artıran elektron mikroskobu tekniklerinde kullanılan teknoloji ve metodolojide ilerlemeler devam etmektedir. Son zamanlarda, Helmholtz Zentrum Muenchen’deki bilim adamları tarafından yapılan bir araştırma, hücrelerin gen ekspresyonunu görselleştirmek için işaretleyiciler olarak farklı boyutlardaki nanoküreleri kullanan yeni bir elektron mikroskopi tekniği geliştirmişlerdir.
Elektron Mikroskobunda Çok Renkli Genetik Etiketleme İhtiyacı
Elektron mikroskopisi (EM) mekanik düzeyde hücresel süreçleri belirlemek, hücre devrelerinin mimarisini ortaya çıkarmak için kullanılan yöntemler açısından altın standart olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, diğer görüntüleme tekniklerini geliştirmek için mevcut olan çok çeşitli floresan proteinleri ve optik raporlayıcılarla karşılaştırıldığında, EM’de kullanım için eşdeğer genetik araçlar sınırlandırılmıştır. Bazı yarı genetik belirteçler geliştirilirken, tamamen genetik bir EM işaretleyicinin oluşturulması daha zor olmuştur. 2019 yılında bilim adamları, ACS nano dergisinde, Almanya’da bulunan bir ekibin, hücre içinde bulunan moleküllerden tanımlanabilecek kadar büyük boyuttaki demir-sekestrasyon protein komplekslerini nasıl aradığını açıklayan bir makale yayınlamışlardır.
Helmholtz Zentrum Muenchen’deki ekiple birlikte çalışan Prof. Dr. Gil Gregor Westmeyer, floresan proteinleri kullanan görüntüleme yöntemlerinin hücrelerdeki küçük yapılar hakkındaki bilgiyi ilerletmede çok değerli olduğunu kanıtlarken, ilgili dezavantajları nedeniyle kullanımlarının ışık mikroskoplarının genel olarak düşük çözünürlüğe kadar sınırlı olduğunu açıklamaktadır. Bu çözünürlüğün üstesinden gelmek için, daha yüksek çözünürlükleri nedeniyle bazı araştırma projeleri tarafından elektron mikroskopları kullanılmıştır, ancak Westmeyer, sınırlayıcı etkisi olan bu teknolojinin yanında kullanılacak çok renkli genetik etiketleme eksikliğinin olduğunu kaydetmiştir. EM ‘ diğerinden bir hücreyi ayırt etme becerisi bulunmaktadır. Bunu akılda tutarak, Westmeyer, ışık mikroskobunda kullanılan çok renkli gen muhabirlerinin EM eşdeğerini oluşturmak için araştırmalarında Helmholtz Zentrum München’in Biyolojik ve Tıbbi Görüntüleme Enstitüsü’nde (IBMI) bilim adamları ekibini yönetmişlerdir. Ekip, nanometrenin çözünürlüğünde görüntüleme, özellikle moleküler makinelerin mühendisliği ve hücresel devrelerin haritalanması için biyomedikal araştırmalar için giderek daha önemli hale gelirken, EM yöntemini geliştirmek için uzak bir çok renkli belirteç eksikliği olduğunu fark etmişlerdir.
![Mikroskopta Boyut Neden Önemlidir?]()
Rengi Geometriyle Değiştirme
Rengi Geometriyle DeğiştirmeGil Gregor Westmeyer ve Helmholtz Zentrum Muenchen’deki meslektaşları birkaç yıldır bakterilerden çıkarılan küçük, toksik olmayan proteinler olan enkapsülinler ile çalışmışlardır. Bu proteinler, hücre içindeki nano bölmeleri otomatik olarak bir araya getirerek, kimyasal reaksiyonların hücre metabolizmasını etkilemeden hücre içi olarak gerçekleşmesini sağlamaktadır. Bilim adamları, genetik programlama yoluyla deney koşullarını değiştirerek hücreler içinde inşa edilen nano bölmelerin çaplarını kontrol edebildiklerini göstermişlerdir. Floresan mikroskobu tarafından kullanıldığı gibi renkler kullanmak yerine, ekip bunun yerine farklı boyutların farklı tonların yerini aldığı geometri kullanan bir yöntem geliştirmişlerdir. Bu nedenle, etiketleme nanokürelerin boyutuna bağlıdır.
EM tarafından üretilen görüntülerde güçlü bir kontrastın üretilmesini sağlamak için ekip, enkapsülinler içinde kapsüllenebilen bir enzim olan ferroksidaz kullanmıştır. Nano bölmelerin gözeneklerinin demir iyonlarının iç lümene akmasına izin verdiği durumda, iki değerlikli demir iyonları ferroksidaz ile üç değerliklerine oksitlenmektedir. Bu, lümen içinde çözünmeyen demir oksitlerin oluşmasına neden olmaktadır. Metaller elektronları emdiklerinden, yoğun kemiklerin x-ışını radyasyonunu emdiği gibi, iyi kontrastlar oluşturmaktadırlar. Bu, EM ile oluşturulan görüntülerde görülen enkapsülinler anlamına gelmektedir.
Anıların Nasıl Saklandığını Araştırma
Araştırmacılar yeni kurulan yöntemlerini nöral devreleri görselleştirmek ve araştırmak için kullanabilmişlerdir. Geleneksel EM çok yüksek bir çözünürlüğe sahip olmakla birlikte, belirli nöronal hücre tiplerini tanımlayamamaktadır. Bununla birlikte, ekip, farklı boyutlardaki nanokürecilere sahip yeni EM yöntemleriyle belirteç olarak, belirli nöronal hücreleri etiketleyebildiklerini, hangi hücre türlerinin bağlantı kurduğunu ve hücrelerin durumu hakkında rapor oluşturduğunu okuduğunu kanıtlamışlardır. Bu yeniliğin kullanımı ile mümkün kılınabilecek birtakım uygulamalar olsa da, yakında geliştirilme aşamasında olan özel bir kullanım, anıların doğasını araştırmaktır.
Bilim adamları, yeni teknolojinin beynin nasıl bağlandığını ortaya çıkarmak ve potansiyel olarak anıların nöronal ağlarda nasıl şekillendiğini ortaya çıkarmak için kullanılabileceğine inanmaktadırlar. Bunun, hafıza kaybı veya kısa süreli ve uzun süreli hafızayı etkileyen diğer bilişsel gerileme biçimleri olan hastaların gelecekteki tedavileri için sonuçları olabilmektedir. Ayrıca bazı detayları neden hatırlandığı ve diğerleri unutulduğu anlamaya yardımcı olabilmektedir, bu da bazı mesleklerde faydalı olabilecek daha iyi ezberleme tekniklerine yol açabilmektedir.
Elektron Mikroskobu Nedir?
Elektron mikroskobu (EM), biyolojik ve biyolojik olmayan örneklerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için bir tekniktir. Biyomedikal araştırmalarda dokuların, hücrelerin, organellerin ve makromoleküler komplekslerin detaylı yapısını araştırmak için kullanılmaktadır. EM görüntülerin yüksek çözünürlüğü, aydınlatıcı radyasyon kaynağı olarak elektronların (çok kısa dalga boylarına sahip olan) kullanımından kaynaklanmaktadır. Elektron mikroskobu, belirli soruları yanıtlamak için çeşitli yardımcı tekniklerle örneğin, ince kesit, immüno-etiketleme, negatif boyama gibi birlikte kullanılmaktadır. EM görüntüleri, hücre işlevi ve hücre hastalığının yapısal temeli hakkında anahtar bilgiler sağlamaktadır.
İki ana elektron mikroskobu türü vardır, bunlar transmisyon EM (TEM) ve tarama EM (SEM)dir. Transmisyon elektron mikroskobu, elektronların bir projeksiyon görüntüsü oluşturarak içinden geçebildiği ince numuneleri (doku bölümleri, moleküller vb.) görüntülemek için kullanılmaktadır. TEM, birçok yönden geleneksel (bileşik) ışık mikroskobuna benzemektedir. TEM, diğer şeylerin yanı sıra, hücrelerin içini (ince kesitler halinde), protein moleküllerinin yapısını (metal gölgeleme ile karşılaştırılır), virüslerdeki ve hücre iskelet filamentlerindeki moleküllerin organizasyonunu (negatif boyama tekniği ile hazırlanır) ve hücre zarlarında protein moleküllerinin düzenlenmesi (donma-kırılma yoluyla) görüntülemek için kullanılmaktadır.
Kaynakça:
ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27671779
nature.com/articles/s41467-018-04227-3#citeas
pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.9b03140
unl.edu/ncmn-cfem/xzli/em/em.htm
Yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu