Mikrobiyal Enzimlerin Geliştirilmesine Yönelik Çalışmalar

Farklı endüstriyel amaçlarda yaygın olarak kullanılan aktinobakteriler gibi çeşitli ve büyük miktarlarda enzimler vardır. Enzimlerin spesifik özellikleri, endüstriyel işlevlerdeki reaksiyonların daha hafif koşullar altında, daha iyi verim ve daha az atık ile yürütülmesine izin verir. Doğal enzimler için daha fazla yeniden tasarım çok önemlidir, çünkü bunlar genellikle biyokatalitik süreçler için uygun değildir. Son zamanlarda, yeni mikrobiyal doğal ve yaratan enzimler, genomik, metagenomik, proteomik, verimli ekspresyon sistemleri ve ortaya çıkan rekombinant DNA’nın son gelişmiş teknolojileri ile eşzamanlı olarak keşfedilmiştir.
Enzim biyoteknolojisinin devam eden gelişimi, endüstriyel biyokataliz alanının iyileştirilmesine yardımcı olur. Termofilik aktinobakteriler, endüstriyel işlemlerde yaygın olarak kullanılan termostabil enzimler üretir. Tersine, psikrofilik aktinobakteriler düşük sıcaklıklarda iyi büyürler ve bunun sonucunda enzimleri düşük sıcaklıklarda daha etkilidir. Gelişmiş DNA dizileme tekniği, endüstride yaygın olarak kullanılan proteinleri sentezleyen tüm genlerin dizilerinin ve işlevlerinin belirlenmesine ve tanımlanmasına olanak tanır. Rekombinant suşlar, enzim üretimini büyük ölçekte potansiyel olarak artırmak için belirli biyoteknolojik araçlar kullanılarak elde edilebilir.
Enzim özelliklerinin iyileştirilmesi, artan bir talep üretilerek gerçekleştirilebilir. Endüstriyel enzimlerin, endüstriyel ölçekte üretime ulaşmak için genellikle daha fazla ince ayara ihtiyacı vardır. Üretimin 100 kat artması nedeniyle rekombinant DNA teknolojisinin büyük endüstriyel ölçeklerde acil kullanılmasıdır. Enzim modifikasyonunun işlevlerini rasyonel yeniden tasarım ve kombinatoryal yöntemlere uyarlamak için iki ana yolu vardır. Bu iki ana yol aşağıdaki gibidir:

Akılcı ve Yenilikçi Tasarım

Bu strateji, enzimatik reaksiyonun 3 boyutlu yapısı ve kimyasal mekanizması hakkında tam bilgi gerektiren amino asit ikamelerine ulaşmak için doğrudan mutasyon kullanmaya dayanmaktadır. Veritabanları protein yapılarını ve dizilerini içerir, bu nedenle yeni bir enzimin referanslarla dizi karşılaştırması, işlevleri veya yapıları zaten bilinen ilgili enzimleri belirleyebilir.

Kombinatoryal Yöntemler

Kombinatoryal yöntemler, kiralite, biyokatalitik etki, katalitik hız, çözünürlük, özgüllük ve stabilite gibi bir enzim molekülü ile ilgili belirli faktörlere dayanır. Bu yöntemler, yeni enzimler bulma yöntemlerinden daha hızlı, daha ucuz ve belirli koşullar altında doğal yöntemlerden daha iyi davranır. Yönlendirilmiş evrim olarak da adlandırılan kombinatoryal yöntemler, protein kodlayan gende PCR, tekrarlanan oligonükleotid yönlendirmeli mutagenez ve kimyasal ajanlar gibi farklı teknikler kullanılarak rastgele mutageneze sahiptir.
PCR tekniği, çok sayıda enzimde hem rastgele hem de nokta mutasyonları ortaya çıkarır. Bu teknikler rastgele rekombinant gerçekleştirir laboratuvar ortamında tipik olarak % 70’den yüksek homolojiye sahip ana genler arasındadır. Nokta mutasyonu, hedef aktif bölge kalıntıları (yaklaşık 10-15 amino asit) ve ona en yakın olanlar (başka 20-30 amino asit) tarafından gerçekleştirilir.
CAS Ting olarak adlandırılan, kitaplıkların aktif site kalıntılarından yapılan iki veya üç kalıntı gruplarından oluşturulduğu bir kombinasyonel aktif site testine dayanan başka bir yol daha vardır. PCR çalıştırılırken, amino asit alfabesi azaltılır ve sadece 12 amino asitten oluşan yeni proteinler sentezlenir. Diğer teknikler karışık eksonlar veya alanlar, döngü bölgeleri, rastgele kesmeler veya kodonların eklenmesi ve silinmesidir. Dahası, rastgele yeniden tasarım teknolojisi, en yüksek aktiviteye sahip, farklı pH değerlerinde ve sıcaklıklarda daha stabil olan, artan kiraliteye, değiştirilmiş substrat özgüllüğüne, organik çözücülerde stabiliteye sahip yeni ve geliştirilmiş enzimler oluşturmak için kullanılır.
Yeni substrat özgüllüğü, aktivitesi, protein farmasötiklerinin ve biyolojik moleküllerin artan biyolojik aktivitesi vardır. Yönlendirilmiş evrim yöntemi, glifosat-N-asetiltransferaz aktivitesini 10.000 kat ve termostabiliteyi 5 kat artırabilir. Yönlendirilmiş evrim çalışması, 2000’den beri piyasada yeni ve geliştirilmiş enzimatik proteinlerin varlığına yol açmıştır.

Rekombinant Mikrobiyal Proteinlerin Üretimi

Moleküler biyoloji teknikleri, özellikle rekombinant DNA, farklı mikroorganizmalardan enzim üretiminde büyük bir etkiye sahiptir. Farklı mikroorganizmalardan bazıları; Bacillus spp, ralstonia ötropha, pseudomonas fluorescens, saccharomyce cerevisiae, pichia pastoris, hansenula polymorpha, aspergillus spp, trichoderma ve E. colidir.
İkincisi, doğru genom modifikasyonu, hızlı büyümesi ve farklı ortamlarda iyi büyümesi nedeniyle bu amaçla kullanılan en yaygın bakteridir. Dahası, pseudomonas fluorescensPfenex Company’nin bakterileri 20 g / L protein üretebilir. Diğer taraftan, saccharomyces cerevisiae bakterilerden daha faydalıdır çünkü genellikle bir klonlama konakçı olarak kullanılır.
Yüksek hücre yoğunluğuna sahiptir, heterolog proteinler üretir ve genetiği diğer ökaryotlardan daha gelişmiştir. Bahsedilen tüm faydalara rağmen, bu maya büyük ölçekte memeli protein endüstrisinde kullanım için uygun değildir. Çünkü hiperglikosilasyon, a-1,3-mannoz kalıntılarının birikimine bağlı hastalarda antijenik yanıt, güçlü ve sıkı düzenlenmiş destekleyicilerin yokluğudur. P. pastorisen yaygın endüstriyel mikroorganizmalardan biri olarak kabul edilir ve 700’den fazla protein üretebilir. Rekombinant protein üretimi, hücre içi proteinler için 22 g / L’ye ve salgılanan proteinler için 14.8 g / L’ye sahiptir.
P. Pastoris 30 g / L’ye kadar rekombinant protein üretebilir. DNA rekombinasyon teknolojisi daha kolay ve elde edilebilir olmasına rağmen, gen ekleme ve delesyonu hala zordur. Endüstriyel düzeydeki sorun, fungal olmayan protein üretiminin homolog proteinlere kıyasla düşük olmasıdır. Bu problemin üstesinden gelmek için zayıf proteaz suşlarının oluşturulması, önemli sayıda gen kopyasının eklenmesi, güçlü fungal promotörlerin kullanılması, verimli sekresyon sinyalleri ve gen gibi birçok strateji vardır. İyi salgılanan bir proteinin bir kısmını veya tamamını kodlayan bir genle füzyonlardır. Chrysosporium şans protein üretimi için büyük bir kabiliyete (50-80 g / L) sahip olduğu, bundan düşük viskoziteli ve düşük proteaz mutantlarının elde edildiği bulunmuştur.

Kaynakça:
https://www.researchgate.net/publication/342454228_Innovative_Techniques_for_Improving_Microbial_Enzyme_Production

Yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu