Kromatografi, bir karışım içindeki bileşiklerin ayrılması işlemidir. Bu, boyut gibi özellikler ve bileşiklerin kromatografinin hareketli ve katı fazlarıyla nasıl etkileşime girdiği ile elde edilebilmektedir. İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) gibi 2D tabanlı (düzlemsel) metotlar, Gaz Kromatografisi (GC) ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) dahil kolon bazlı metotlar arasında değişen farklı kromatografi türleri vardır. Kromatogram üretmek için kromatografinin çalıştırılması, sabit bir faz (katı veya sıvı) üzerinde mobil bir fazın (sıvı veya gaz) kullanılmasını içermektedir ve bileşiklerin iki fazla etkileşime girme şekli ayrılmalarına neden olmaktadır. Örneğin, bir bileşik sabit faza güçlü bir şekilde bağlanırsa, sabit faza güçlü bir şekilde bağlanmayan başka bir molekülden daha yavaş hareket edecektir.
Düzlemsel bir kromatografi tekniğinde, bir bileşik durağan faza daha güçlü bir şekilde bağlanırsa, o kadar güçlü bağlanmayan bileşiklerden daha yavaş ilerlemektedir. Bu nedenle, bir karışımdaki farklı bileşiklerin kat ettiği mesafe, kromatogramda gözlenmektedir. Kolon kromatografisinde, bir bileşik durağan faza daha kuvvetli bir şekilde bağlanırsa, o zaman bu, güçlü bir şekilde bağlanmayan bileşiklerden sonra sütundan elenmektedir veya buradan ayrılmaktadır. Bunların daha uzun bir tutma süresine sahip oldukları söylenmektedir.
Adli Tıpta Kullanım
Düzlemsel Kromatografi
Kromatografi en temel seviyesinde ince tabaka kromatografisi (TLC) gibi düzlemsel teknikleri içermektedir. Bu, üzerine numunenin tespit edildiği düz bir taşıyıcı tabaka üzerinde ince bir sabit faz tabakasının (tipik olarak silika, alümina, selüloz veya bir jel nüfuz etme malzemesi) kullanımıdır. Analit bileşenleri, farklı oranlarda kılcal hareketle matris içinden çekilir, böylece tutma faktörlerini (Rf) hesaplamak için kat edilen mesafelerin ölçülmesine izin verilmektedir. Noktaları görselleştirmek için UV ışığı gerekebilmektedir. Adli bilimlerde, düzlemsel kromatografi, mürekkepler, boyalar ve ilaçlar arasında ayrım yapmak için hızlı ve ucuz bir yöntem olarak kullanılabilmektedir, ancak gerçekçi olarak daha karmaşık kromatografik teknikler daha uygundur. İki mürekkep örneğinin aynı olup olmayacağını belirlemek için temel düzlemsel kromatografi teknikleri kullanılmaktadır. Örneğin, iki metin parçasında kullanılan mürekkep, düzlemsel kromatografi de benzer bir ayrım gösterip göstermediklerini görmek için karşılaştırılmaktadır. Başka bir örnek olarak, bir banka faturası (notu) mürekkeple işaretlenmektedir ve bu fatura çalınırsa, bir adli bilim adamı hırsızın ellerinde aynı mürekkebin tespit edilip edilemeyeceğini görebilmektedir.
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC)
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), bir sıvı hareketli fazın ilgilenilen analiti taşıdığı analitik bir kolonun içine yerleştirilmiş katı bir sabit faz kullanılmaktadır. Tipik olarak kolonlar, ayrılacak analitlerin tipine bağlı olarak farklı bağlı maddelerle birlikte silis bazlı bir sabit faz içermektedir. Bu, kullanılan mobil faz tipinde (numuneyi kolondan taşımak için kullanılan sıvı) eşittir. Örneğin, normal fazlı HPLC, polar olmayan bir mobil faza sahip bir polar sabit faz kullanacak, oysa ters fazlı kromatografi tersini kullanacaktır. HPLC cihazları, bir tür dedektör, genellikle UV/Vis, floresan veya kütle spektrometri dedektörleri ile birleştirilecektir. Bunun amacı, HPLC kolonundan ayrıldıklarında numunenin bileşenlerini tespit etmektir. Yani HPLC, katı bir sabit faz ve bir sıvı mobil faz kullanan bir kolon kromatografi yöntemidir. Bununla birlikte, mobil fazın kolondan yavaşça damlatıldığı sıvı kromatografi yöntemlerinin aksine, yüksek basınçta kolondan itilmektedir. HPLC, patlayıcılarda kullanılan farklı maddeler farklı özelliklere ve dolayısıyla farklı tutma sürelerine sahip olacağından patlayıcıları analiz etmek için kullanılmaktadır ve bazı ilaçlar HPLC ile de tespit edilebilmektedir.
Gaz Kromatografisi (GC)
Gaz kromatografisi (GC), bir maddenin tanımlanmasına ve miktarının belirlenmesine yardımcı olmak için bileşiklerin ayrılması için bir yöntemdir. Analiz için mevcut numunenin tipine ve miktarına bağlı olarak her biri düşünülebilen çok sayıda olası enjeksiyon yolu vardır. Numune GC’ye sokulurken buharlaştırılmaktadır ve taşıyıcı gaz tarafından analitik kolona süpürülmektedir. Taşıyıcı gaz, gaz kromatografisinde hareketli fazdır ve daima hidrojen, helyum veya azot gibi etkisiz bir maddedir. Gaz tedarik hatları, adli analizlerde özellikle hayati bir özellik olan numunelere ve hasar cihazlarına müdahale edebilecek nem, oksijen ve hidrokarbon kirliliklerini yakalamak için genellikle çeşitli cihazlarla birleştirilmektedir. Sütunun içinde sabit bir faz vardır ve en yaygın olarak gaz kromatografisinde, sabit fazın sütunun iç duvarlarını kapladığı bir kılcal sütun kullanılmaktadır. Analitler kolondan geçerken, bileşenler gaz halindeki mobil faz ve sabit faz ile farklı bir ölçüde etkileşime girecek, bu da belirli özelliklere bağlı olarak kolonda değişen sürelerde bileşenlerin kalmasına ve böylece farklı elüsyon sürelerine ayrılmaktadır, ayrıca zaman bir bileşenin sütundan ayrılması ve algılanması için alınmaktadır.
Tek başına gaz kromatografisi işlemi özellikle yararlı değildir, bu nedenle elüsyon bileşenlerinin bir kromatogramda bir tepe noktasıyla temsil edilmesine izin verecek olan bir çeşit detektör ile birleştirilmektedir. Bu piklerin tutulma süresi bileşiğin tanımlanmasında faydalı olmaktadır ve boyut (yükseklikten ziyade tipik olarak pik alan) nicelleştirmede kullanılmaktadır. Yaygın GC detektörleri arasında alev iyonizasyon detektörü (FID) ve kütle spektrometresi (MS) bulunmaktadır.
Kısacası gaz kromatografisi veya gaz-sıvı kromatografisi, bir sıvı sabit faz ve bir gaz hareketli fazın kullanılmasını içermektedir. Adli tıpta, ölen bir kişinin ölümden önce alkol veya ilaç alıp almadığını belirlemek ve zehirlenip zehirlenmediğini belirlemek için gaz kromatografisi kullanılmaktadır. Bir kişinin nasıl öldüğünü belirlemeye çalışırken bu çok önemli bir bilgidir. Suç mahallinden kan ve lif gibi örnekler de araştırmaya yardımcı olmak için gaz kromatografisi ile analiz edilmektedir. Lu ve Harrington tarafından 2007 yılında yayınlanan bir rapor, kundaklamada kullanılan yanıcı sıvıları tespit etmek için gaz kromatografisinin kullanılabileceğini öne sürmüştür.
Dedektör-Kromatografinin Kütle Spektrometrisine Bağlanması
Kromatografi yöntemlerinin, bileşiğin saptanması için bir yönteme ihtiyacı vardır, çünkü tekniğin kendisi sadece bunları ayırmak için hareket etmektedir. Genellikle, sıvı veya gaz kromatografısinden elüte edilen numuneler, yüklü parçacıkları boyutlarına göre ayıran bir kütle spektrometresinden geçirilebilmektedir. Kütle spektrometrisine birleştirilmiş bir kromatografi yöntemi kullanmak, bu nedenle, bilinmeyen bir maddenin olabileceği olası bileşiklerin aralığını etkili bir şekilde daraltabilmektedir. Adli tıpta gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) oluşturulmuş olsa da, sıvı kromatografi-kütle spektrometrisinin (LC-MS) kullanımı daha yakın zamanda kurulmuş bir konudur. LC-MS tekniklerinin geliştirilmesi, GC-MS ile analiz edilemeyen bileşiklerin artık bu teknik kullanılarak tanımlanabileceği anlamına gelmektedir.
Adli Uygulamalar
Çok temel bir analitik test olarak, mürekkeplerin ve boyaların analizine düzlemsel kromatografi uygulanmaktadır. Bir analistin aynı mürekkebi kullanarak iki yazı parçası yazılıp yazılmadığını tespit etmesi gerekebilmektedir ve kromatografi en azından bunun için bir varsayım testi olarak hareket etmenin bir yoludur. Mürekkep örnekleri, ayırma ortamına yerleştirilecek ve matristen geçmesine izin verilecektir. İki farklı mürekkep örneği, sabit faz boyunca farklı bir hızda hareket edebilmektedir, bu da aynı kaynaktan gelmeyeceklerini göstermektedir. Aynı prensip boyalara uygulanabilmektedir örneğin, banknotlar bir suçlunun (örneğin bir hırsız) eline geçerse, şüphelinin ellerindeki boyanın çalınan parayı işaretlemek için kullanılan boya olup olmadığını belirtmek için inceleme altında kromatografi kullanılmaktadır.
Patlayıcı yapımında kullanılan malzemelerin analizinde genellikle yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanılmaktadır. Patlayıcı bir aygıtın üretiminde kullanıldığından şüphelenilen bir madde ile uğraşıldığında HPLC, malzemenin tanımlanmasına yardımcı olmak için kalitatif analiz sağlamak için kullanılmaktadır. Farklı maddeler, benzersiz tutma sürelerine sahip HPLC kolonundan farklı bir hızda ilerlemektedir. Bu tutma süreleri, bir numune karışımındaki bileşenleri tek tek tanımlamak için kullanılmaktadır. Adli bilimlerde kullanılan en doğrulayıcı kromatografik teknik, maddelerin tanımlanmasına izin verebilecek kütle spektrometrisi ile birleştirilmiş gaz kromatografisi veya sıvı kromatografisidir. Kütle spektrumları kütüphaneleri analistin kendi uzmanlıklarıyla birlikte bir numuneyi tanımlamasına yardımcı olmak için kullanılmaktadır. Teknik genellikle diğer testlerle birlikte kullanılacaktır. Örneğin, şüpheli yasadışı maddelerin analizinde, analiste uğraştıkları uyuşturucunun türü hakkında bir ipucu vermek için olası testler kullanılabilmektedir. Ancak bu testler kimliği doğrulamamaktadır, bu nedenle LC-MS ve GC-MS daha kesin bir tanımlama sağlamak için kullanılabilmektedir.
Kaynakça:
https://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html
https://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009912010003486
Yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu