Bilim ve teknolojideki evrimle birlikte, en yeni ekipmana olan ihtiyaç her geçen gün güçlenmektedir. İlk olarak, çıplak insan gözünün göremediği mikro nesneleri izlemek için ışık mikroskopları kullanılmıştır. Daha sonraları, daha yüksek çözünürlüklü görüntüleme aletlerine duyulan ihtiyaçla birlikte, çok daha net ve yüksek çözünürlüklü 2D görüntüler veren elektron mikroskopları tanıtılmıştır.
Genellikle, 2B bölümlerin mikrograflarında 3B karakteristikler üretmek için stereolojik kurallar vardır. Ancak bu üretim yöntemi, karmaşık yapılara sahip nesneler için 3B görüntüler üretememiştir. Karmaşık yapıların bile 3 boyutlu modellerini görebilmek için birçok yeni teknikler geliştirilmiştir. Erken aşamada, numunenin 3D analizi için senkrotron ve X-ışını tabanlı tomografik teknikler icat edilmiştir. Bunların her ikisi de iletim teknikleridir, oysa X-ışını iletim tekniği örneklerin farklı fazları arasındaki soğurma farkını kullanır ve nesnenin 3 boyutlu bir görüntüsünü yeniden oluşturur. Odaklanmış iyon ışını (FIB), konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile kafa kafaya giden 3D görüntüleme tekniklerinden biridir. Bu ikisi arasındaki en büyük fark, CLSM’nin tarama amacıyla LAZER kullanması, FIB’nin ise son derece odaklanmış olmasıdır.
FIB için öncü endüstri, 1980’li yılların sonlarına kadar temelde yarı iletken üretim endüstrisi olmuştur. Ancak daha sonra, malzemelerin karakterizasyonları için uygulamaları FIB’leri malzemelere ve biyolojik çalışmalara tanıtılmıştır. Malzeme bilimi çalışmalarında, FIB malzeme arayüzlerini ve bunların arızaya yol açan kusurlarını incelemeye yardımcı olur. Ayrıca biyolojik bilimlerde, esas olarak hücreler ve dokular arasındaki arayüzü incelemek için kullanılmıştır. Başlangıçta FIB’ler, enerjik iyon demeti kullanan tek kolonlu ve kiriş tabanlı enstrümanlardır, malzemelere çapraz kesit üretimi için Galyum iyonu, ardından görüntü üretmek için ikincil iyon demetidir. FIB, yaklaşık 5 nm hüzme çapı ile 30 ile 50 keV arasında değişen enerji ile sıvı metal iyon kaynağı (LIMS) ile üretilen oldukça hızlandırılmış bir Ga 3+ iyon demeti kullanır.
FIB temelde bir litografik tekniktir, mikro ve nano ölçeklerde çok kontrollü ve hassas yazı sunar. Ancak taramalı elektron mikroskobu (SEM), elektron kırınım X-ışını spektroskopisi ve iletim ile tirelendiğinde elektron mikroskobu, yüksek çözünürlüklü 3D görüntüler üretir. EDS ile tirelendiğinde FIB, çok yüksek çözünürlüklü görüntülerin yanı sıra çok doğru element analizi sağlar, ancak SEM ile tirelendiğinde çok yüksek çözünürlüklü ve temiz 3D görüntüler üretir.
FIB-SEM heceleme, SEM ile kontrast yoluyla 3 boyutlu görüntüler üretmek için geliştirilmiştir . SEM-FIB, numunenin ilgili yüzey alanını ve frezeleme ile seçilen alanın enine kesitlerinin görüntülerini seçmek için çift ışınlı mekanizma kullanır. Yüzey görüntüleri SEM tarafından yakalanır ve otomatik performans için komut dosyası oluşturma rutini takip edilir. Üretilen 3D görüntülerin çözünürlüğü tamamen SEM çözünürlüğüne ve odaklanmış iyon demetinin kesme hassasiyetine bağlıdır. Onlarca nanometre çözünürlüğünde yüksek çözünürlüklü görüntüler bu teknikle üretilirken, daha geriye saçılmış elektronları çözmek için iyi bir alternatiftir. Oysa Enerji Dağılımlı X-Işını Spektroskopisi (EDS) ile bağlantılı FIB-SEM, elemental analizle çok yüksek çözünürlüklü tomografi verir. FIB-SEM ile hecelenmiş elektron geri saçılım kırınımı (EBSD), tane boyutu, kusurlar ve kazanç sınır kalınlığı hakkında bilgi verir ve bu da onu çok güçlü bir araç haline getirir.
Biyolojik numunelerin analizi, kullanımı, kararlılığı ve elektron ışınının numunede bulunan biyolojik bileşiklerle etkileşimi nedeniyle her zaman önemli bir sorun olmuştur. Biyolojik örnekler iletken olmadığından, yüksek çözünürlüklü ve doğru görüntüler elde etmek gerçekten zordur. Yöntemlerden birindeki araştırmacılar, oda sıcaklığında veya hafif ısıtmada numune kurutmayı kullanmışlardır. Ancak bu yöntemde, numune yapısındaki değişiklikler ve numunenin kimyasal bileşiminin değişimi belirsizliğini korumaktadır. FIB-SEM’in getirdiği en büyük gelişme, aynı anda bir iyon ve elektron ışını gönderen birincil ve ikincil sütunların varlığıdır. Bu da çakışan öğütme ve taramaya neden olur. Bu özellik, bu tekniğin farklı çözünürlüklerde ve büyütmelerde biyolojik numune çalışması için kullanımına büyük ölçüde katkıda bulunur. Ayrıca, birçok araştırmacının prokaryotik ve ökaryotik tek hücreden, dokulara ve bunların etkileşimlerine kadar değişen hücre ve dokulara bakmasıyla ilgilenmiştir.
Tarih ve Enstrümantasyon
Şimdiye kadarki ilk alan emisyon bazlı FIB, Swanson ve Orloff ve Levi-Setti tarafından 1975 yılında geliştirildi ve bu, gaz alanı iyonizasyon kaynaklarına (GFIS’ler) dayanmaktadır. FIB’nin ilk amacı, yarı iletken endüstrisindeki devreleri onarmak ve düzenlemektedir. Ancak günümüzde, çeşitli iyonizasyon kaynakları ticari olarak veya araştırma aşamasında bir prototip olarak mevcuttur. Yarı iletken endüstrisinde devre modifikasyonu için FIB alanına, malzemeler için bir karakterizasyon aracına ve SEM ile bağlandığında biyolojik örneklere doğru ilerlemektedir.
Halihazırda mevcut FIB’ler, genellikle LMIS-FIB tomografisi olarak adlandırılan sıvı metal iyon kaynakları ile donatılmıştır. Bu LIM kaynakları, daha kararlı olmaları, uzun ömürlü ve düşük erime noktalı ışınlar üretme kabiliyetine sahip oldukları için önceki iyon kaynaklarına göre bir kenara sahiptir. Ve çok daha düşük sıcaklıkta enerjiye sahip yüksek enerjili iyon kaynaklarına yol açar. 10 nm’nin altındaki hatlara ulaşabilen H + iyonlarını kullanan gaz alanı iyonizasyon kaynakları (GFIS’ler) de kullanılmaktadır.
FIB’nin tomografik yönleri, SEM ile tirelendiğinde geliştirilir. FEI, 1993 yılında FIB / SEM çift kiriş kurulumunu başlatan ilk şirkettir. Örnek aşamasına göre iyon ve elektron ışınları arasındaki açı 10–82 0 aralığındadır ve FIB ve SEM’in çalışma prensibi, ışın kaynağı arasındaki tek farkla hemen hemen aynıdır. SEM durumunda, çok iyi odaklanmış bir elektron ışını kullanılırken, FIB durumunda, işi yapmak için oldukça hızlandırılmış bir iyon ışını kullanılır. İyon ışını seçilen alanı dilimlemek için kullanılırken SEM dilimlenmiş numuneyi aynı anda tarar.
SEM’deki elektron ışını, genellikle W-teli veya bir lantan heksabromid ucu olan bir elektron kaynağından üretilir. Yüksek odaklanmış elektron ışını numuneye çarptığında, ikincil elektron (SE1) adı verilen atomik yörüngeden düşük enerjili bir elektronu çıkarır. Ve aynı atomun daha yüksek enerjili elektronuyla doldurulan bir boşluğa yol açar. Bu, bir X-ışınının serbest bırakılmasıyla sonuçlanır, X ışını şeklinde açığa çıkan enerji, elektronu devre dışı bırakılan elementin parmak izi enerjisidir. Bu röntgen, numunenin kimyasını incelemeye yardımcı olur. Bu amaçla bir X-ışını detektörü, genellikle EDS (enerji dağıtıcı X-ışını spektrometresi) kullanılır. Bazı birincil elektronlar atomun çekirdekleriyle temasa geçer ve bunlar daha sonra geri saçılmış elektron adı verilen çevreye geri yansıtılır.
Oysa bu elektronlardan bazıları ortama geri yansıtılırken bir elektronu yok ederek ikincil elektron 2 (SE2) adı verilen ikincil bir elektron verir. Yayılan tüm bu elektronlar, kaynak yerlerine bağlı olarak numune hakkında belirli bilgiler içerir. Örneğin, SE1 yüksek çözünürlüklü topografik bilgi içerir ve elektron ışınının çarpma noktasından daha yakın mesafeden kaynaklanır. SE2 numunenin derinliklerinden kaynaklanır, SE1’den daha yüksek açıda yansıtılır ve numune hakkında düşük çözünürlüklü topografik bilgiler içerir. Numune yüzeyinden üretilen SE1, her yönden yayılan elektronları toplamak için üzerinde pozitif yüklü bir pencere bulunan elektron detektörü tarafından çekilir. Toplanan bu elektronlar daha sonra büyütülür ve sonuçları kaydedilir. 
Elektron ışını taraması numune yüzeyini tarayarak tarama görüntüsüne yol açar. SEM’de, vakumda üretilen elektronlar, bir kondansatör merceğinden odaklandıkları yerden bir katot tarafından çekilir. CL’den bu ışın, elektronu hızlandıran ve daha sonra bir saptırma bobininden geçen manyetik mercekten geçer. Bu bobinin görevi, ışını numuneye seçilen herhangi bir açıda saptırmaktır. Ardından ışını numune yüzeyine odaklayan son mercek vardır. Havalandırmada geri saçılan elektronları yakalayan geri saçılmış bir elektron detektörü vardır. Bu elektronlar, yoğunlaştırıcı bir mercekten odaklandıkları yerden numunenin kimyasal bileşimi ve kristal yapısı hakkında bilgi verir.
FIB durumunda, iyonlar için önceden kullanılan kaynak, yüksek sıcaklıkta ısıtıldığında iyonları serbest bırakan termiyonik elektron iyon tabancasıdır (TEIG). Son zamanlarda FIB’ler ise iyonları kaynaktan almak için elektrik alanının uygulandığı alan emisyon iyon tabancaları (FEIG’ler) kullanılır. Elektronlar daha sonra bir mercek yardımıyla odaklanır ve onları yüzeye odaklayan saptırma bobini olarak bilinen tarama bobininden geçer. İyon ışınının bu etkileşimi, numunenin çok küçük bölümlerini püskürtmek suretiyle iyonların (beş veya + yüklü türler) ve nötr atomların emisyonuna neden olur. İyon detektörü iyonları yakalar ve numunenin görüntüsünü oluşturur.
İyonik ışın, iyonların ve nötr atomların püskürtülmesinin yanı sıra, bazı ikincil elektronları da yok eder. İyon demetini kullanmanın temel nedeni, ışının enerji farkı ve çarpma çapı farkıdır. Örneğin, He+ ışını, bir elektron ışınınınkinden neredeyse 7600 kat daha enerjiktir. Dalga boyu ise SEM’de kullanılan elektron ışınının yaklaşık 100 katıdır, böylece bu ışın kolaylıkla 10 nm’nin altındaki spot boyutuna ulaşabilir.
Bu iki teknik birleştirildiğinde çok yüksek çözünürlüklü görüntüler verir. SEM’i FIB ile karşılaştırıldığında, SE2’lerin sayısı SEM görüntüsünün çözünürlüğünü bozarken, FIB durumunda geri saçılma minimumdur. Ve ikincil elektronların numunenin tek tabakasından atılmasına neden olur. Sonuçta numunenin derin ve yüksek noktaları arasında çok yönlü kontrast ile çok yüksek çözünürlüklü görüntü elde edilir.
Kaynakça:
https://www.researchgate.net/publication/337323641_Focused_Ion_Beam_Tomography
https://link.springer.com/article/10.1007/s11661-004-0142-4
Yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu