Bilgiustam
Türkiye'nin Bilgi Sitesi

Tüm Ekzom Dizileme Nedir?

0 36

Bir organizmanın tüm ekzom setinin nükleotid sekans sıralarının, yüksek verimli bir DNA sıralama yöntemi kullanılarak belirlenmesi, tam veya tüm ekzom sekanslama olarak bilinir. Üç farklı biyomolekül, bir DNA yani pentoz şekeri, nitrojen bazları ve trifosfat oluşturur. Tüm DNA, bir organizmanın genomunu oluşturan kromozomlar üzerinde düzenlenmiştir. Tüm somatik hücreler aynı genoma veya genetik içeriğe sahiptir. Genom, sırasıyla % 3 ve % 97 kodlayıcı DNA ve kodlayıcı olmayan kısımları içerir. Kodlama kısmı, çeşitli proteinleri yapan genler olarak bilinir. Genler, intronların yanı sıra bir dizi eksondan oluşur ve promotör bölge tarafından yönlendirilir.
Burada intronlar, mRNA çevirisi sırasında çıkarılan kodlayıcı olmayan araya giren dizilerdir. Nihai bir ürün, bir protein yapmak için orada sadece eksonlar kalır. Yalnızca kodlama eksonlarını sıralamak için kullanılan teknik, ekzom dizileme olarak bilinir. Bu, bir ekzomun ne olduğunu ve tüm ekzom dizileme platformunun nasıl çalıştığına dair bilgiler bulunmaktadır.

Ekzom Nedir?

Bir genin yalnızca eksonları protein üretebilir ve araya giren diziler, transkripsiyon sırasında çıkarılır ve bu nedenle nihai mRNA oluşumunda yer almaz. Bir gen sadece tek bir eksondan oluşmaz, aynı zamanda bir gende bir veya birden fazla ekson vardır. Bir genomun tüm eksonlarının tamamı bir ‘ ekzom’ veya ‘bütün ekzom’ olarak bilinir. Bu basitçe söylemek gerekirse, bir organizmanın genomunun tüm genlerinin yalnızca bir kodlama bölgesinin tamamı, bir ‘ekzom’ veya ‘ekzom kümesi’ veya ‘tüm ekzom’ olarak bilinir. Ekzom, tüm genomun yalnızca % 2’lik bir bölümünü içerir.
Büyük ölçüde, genlerin kodlama bölgelerinde meydana gelen mutasyonlar daha zararlıdır. Böylece, tüm ekzom dizisini sıralarsak, mutasyona uğramış ekson, onunla ilişkili genetik bir hastalık ve fenotipik etkisi hakkında bilgi alınabilir. İnsan genomunda toplam genomun % 1 ila 2’sini oluşturan toplam 180.000 ekson mevcuttur.

Tam (Tüm) Ekzom Dizileme Nedir?

Sekans bilgisi almak için DNA Sekanslama yapılır. Bir sıralama makinesi, bir hedef dizide veya bir gende bulunan her nükleotidi tanımlar ve tespit eder. Tam ekzom dizileme, bir genomun tüm kodlama bölgesini sıralayacak kadar güçlü, yeni nesil yüksek verimli bir DNA dizileme tekniğidir. İlk dizileme yöntemi Sanger tarafından geliştirilmiş ve Sanger dizileme yöntemi olarak biliniyor ve laboratuvarlarda 1000 ila 1500 nükleotide kadar daha küçük DNA parçalarını dizmek için hala kullanılmaktadır. Ancak, Sanger yöntemi o kadar hızlı değildir, bu nedenle tüm genomu sıralamak için; birkaç yıl sürer! Öte yandan, yeni nesil dizileme yöntemi o kadar hızlı ki, 3 milyar bazlık tüm genomu bir gün ila bir hafta içinde sıralayabilir. Tam ekzom dizileme yöntemi, tüm ekzom setini sıralayabilir. Bu nedenle hastalığa neden olan varyantların% 85’inden fazlası sıralanabilir veya tespit edilebilir.

Kodlama bölgelerindeki mutasyonun daha zararlı olduğu kabul edilir, ancak kodlama bölgesi dışındaki birkaç mutasyon da kişinin sağlığını olumsuz etkileyebilir. Örneğin, beta-talaseminin IVS 1-5 ve IVS1-1 mutasyonu gösterilebilir. Ancak genetik hastalıklarla ilişkili mutasyonların, değişikliklerin ve kopya sayısı varyasyonlarının % 80’inden fazlası kodlama bölgelerinde, araçlarda, ekzomlardadır. Bir dizi ekzomu sıralamak, tüm genomu sıralamak yerine daha uygundur. Tüm genom dizileme daha fazla zaman alır ve aynı zamanda daha maliyetli bir süreçtir. Sonuç olarak, bütün exome sekanslama tekniği, iki sınırlamalarını aşmak için gelişmiş, yani alel, çeşitli türevleri bulmak için, ya da düşük maliyetli deneylerde bir hastalık ile ilişkili yerlerin. Özellikle, sadece protein kodlayan bölgeleri değil, aynı zamanda diğer microRNA veya lincRNA’ların eksonlarını da diziler.

Tüm Ekzom Dizileme Süreci

Bu sıralama platformunun süreci, yeni nesil dizileme veya diğer yüksek verimli sıralama yöntemlerine biraz benzemektedir. Süreç de bir şekilde karmaşık ama basitçe açıklamak gerekirse süreç şu şekilde anlatılabilir:
İzole aşaması
İlk olarak, yüksek kaliteli DNA, tuzdan arındırma yöntemi kullanılarak izole edilir veya DNA ekstraksiyon yöntemini kullanmaya hazırdır. Bununla birlikte, Ekzom dizileme üreticisi tarafından önerilen bir DNA ekstraksiyon yöntemini şiddetle tavsiye edilmektedir. Tüm ekzom dizilemede kullanmak için herhangi bir DNA ekstraksiyon yöntemiyle iki kriter yerine getirilmelidir, biri DNA kalitesi yaklaşık 1.80 ve miktar 100-250 ng olmalıdır. DNA ekstraksiyonunu bir hedef zenginleştirme süreci takip eder. Hedef zenginleştirme sürecinde, tüm ekzom seti bir DNA örneğinden izole edilir. Hedef zenginleştirme yapmadan önce DNA’yı parçalamak için fiziksel veya enzimatik yöntemler gerçekleştirilir.
DNA parçalanmasına gelindiğinde, DNA fragmanları yapma niyeti, testin karmaşıklığını azaltmaktır. Daha büyük DNA parçalarının sıralanması zordur, bundan böyle küçük DNA parçaları yapılmaktadır ve bir kitaplıkta toplanmaktadır. Bir kütüphane, tüm DNA fragmanların bulunduğu bilinen bir yerdir. Parçalanmış DNA, kör uçların üretildiği ve adaptörlerle bağlandığı kitaplık hazırlığına işlenir.
Hedef zenginleştirme aşaması
Hedef zenginleştirme, incelemek veya dizilemek istediğimiz genomik bölgeleri seçmek için kullanılan yöntemler veya yöntemler koleksiyonundan başka bir şey değildir, bu durumda ekzomlardır. Dizi tabanlı yakalama veya çözüm içi yakalama yöntemi gibi yöntemleri kullanarak, Ekzomlar gibi sıralamak istediğimiz bölgeleri seçebilir ve izole edilebilir. Dizi-bazlı yakalama yöntemi hedef DNA dizilerine prob, spesifik bir katı yüzey üzerinde immobilize edilmiş olan, geleneksel yöntemlerden biridir. Ekzom sekansları her prob üzerinde hibridize edilir (tamamlayıcı sekansına sahip) ve ardından PCR’de amplifiye edilir.
Bununla birlikte, kör uçların üretilmesi, adaptör ligasyonları ve yıkama gibi adımlar da geleneksel mikrodizi gibi buna dahildir. Önceden sıralama bilgilerinin gerekliliği, zahmetli örnek işleme, kullanımı zorlaştırır. İçinde çözelti yakalama yöntemi, problar DNA fragmanı hibridize olduğu (boncuklar veya manyetik boncuk) çözeltisi içinde vardır. Hibridize edilmemiş DNA’nın geri kalanı yıkanır ve ilgilendiğimiz DNA fragmanlarının bulunduğu boncuklar dizilir. Yani bunlar, eksomları sıralamak için hedef zenginleştirme yapmanın iki yöntemidir. Örnek hazırlama tamamlandıktan sonra, yıkama adımı gerçekleştirilir ve ardından kitaplık saflaştırılır. DNA’yı parçalara ayırdık, böylece ekson parçalarına ve sıralamak istemediğimiz diğer DNA parçalarına sahip olunur. Yıkama, diğer tüm gerekli olmayan DNA’ların yanı sıra diğer kimyasalların izlerini de ortadan kaldırır. Numunenin ayrıştırılmasıyla, saf bir ekson fragmanları kütüphanesi DNA sekanslaması için hazırdır.
Kitaplık, sıralama için işleniyor. Sıralama makinesi, tüm ekzom kitaplığının her dizisini okur ve sinyaller biçiminde bir çıktı verir. Milyonlarca kısa sıralı özel okumalar elde etmek için, büyük ölçüde paralel yüksek verimli sıralama gerçekleştirilir. Kısacası, bir köprü büyütme sürecinde, her uzama aşamasından sonraki her ddNPT, mekanizmanın tamamı olan bir NGS’de algılanır. Bilgisayar yazılımı, her nükleotidi sırayla düzenler ve her parçanın sırasını belirler. Kütüphane düzenlemelerine bağlı olarak, ayrı parçalar düzenlenir ve tüm ekzom dizisi bir bilgisayar tarafından oluşturulur.

Tüm Ekzom Dizilemenin Avantajları ve Uygulamalar

Mevcut sıralama yöntemi, yüksek verimli, hızlı, güvenilir, nispeten uygun maliyetli ve doğrudur. Genomun tüm kodlama bölgesini kapsar. Dizileme verileri, 90 ila 100 GB tüm genom dizilemesine kıyasla yalnızca 4 ila 5 GB çıktıdır. Hastalıkla ilgili bilinen genotipler ve aleller için kullanılır. Bir anormallikle ilişkili kodlama bölgelerindeki değişikliği bulmak için etkilidir. Genetik hastalığı taramada, yeni varyasyon ve mutasyonların tanımlanmasında, popülasyon genetiğinde, kanser genetiğinde ve diğer alanlarda kullanılır.
Mevcut yöntem oldukça doğrudur ve bu nedenle multigenik hastalık için çok sık kullanılmaktadır. Örneğin, Kabuki hastalığının gen mutasyonları, paroksismal kinesigenik diskinezi, konjenital klorür diyare ve spinoserebellar ataksi, tam ekzom dizileme ile taranır. Yeni Mendel hastalığı ile ilişkili varyantların keşfedilmesinde ve nadir varyantların ve gen haritalamasının tanımlanmasında da uygulanabilir.

Tüm Ekzom Dizilemenin Dezavantaj ve Sınırlamaları

Ekzom dizileme, DNA’yı dizilemek için kullanılan son teknoloji bir tekniktir, Fakat çok önemli bir sınırlaması vardır. Öncelikle hastalığa neden olan mutasyonların tümü eksonlarda bulunmaz. Bir hastalık veya hastalık grubu ile ilişkili geniş bir mutasyon spektrumu ile karşılaşılsa da bazıları kalmıştır. Tüm genomun mutasyonlarını, değişikliklerini veya kopya sayısı varyasyonlarını kapsamak için, shotgun dizileme veya klon dizileme ile klonlama gibi bir tam genom dizileme yöntemine ihtiyaç vardır ve bu yöntemde bu mümkün değildir. Mevcut yöntemin yine bir başka sınırlaması, bazı eksonların dizi benzerliğidir. Tüm eksonlar aynı değil ama bazıları da farklı değildir! Birkaç ekson, diğer eksonlar arasında paylaşılan tekrarlayan DNA dizilerine sahiptir. Bunlar doğru tahmin edilemez.
Tam ekzom dizileme yöntemi, WGS ile karşılaştırıldığında daha hızlı, daha ucuz ve doğrudur. Yalnızca mRNA’ların değil, aynı zamanda siRNA ve miRNA’nın eksomlarının da sekans bilgilerini verebilir. Bununla birlikte, sonuç almak için kapsamlı hesaplama bilgisi, yüksek hızlı süper bilgisayarlar ve uzman insan gücü gereklidir. Buna ek olarak, zahmetli elektroforez adımlarına ihtiyaç duyulmaz. Ekzom dizileme klinik, araştırma ve akademisyenler için faydalıdır. Bir hastalığın prognozu, teşhisi ve patofizyolojisi de analiz edilebilir. Mevcut yöntem, mendelyan olmayan veya nadir Mendel bozukluklarını incelemek ve hastalığa neden olan nadir genetik varyantları bulmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Az sayıda popülasyonda bulunan varyantlar da tespit edilebilir.

Kaynakça:
https://ghr.nlm.nih.gov/primer/testing/sequencing
https://www.illumina.com/techniques/sequencing/dna-sequencing/targeted-resequencing/exome-sequencing.html
http://www.biocompare.com/Editorial-Articles/354629-Exome-Sequencing-vs-Whole-Genome-Sequencing/

Yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu

Cevap bırakın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak.