Bilgiustam
Türkiye'nin Bilgi Sitesi

Yeni Nesil Dizileme (NGS- Next-Generation Sequencing) Nedir?

0 29

Farklı dizileme teknolojileri kullanan birkaç yeni nesil dizileme (NGS) platformu vardır. Hepsi milyonlarca küçük DNA parçasının sıralanmasını paralel olarak gerçekleştirir. Tek tek okumaları insan referans genomuna eşleyerek bu parçaları bir araya getirmek için biyoinformatik analizleri kullanılır. Böylece doğru veriler ve beklenmedik DNA varyasyonları hakkında bir iç görü sağlarlar. Yöntemin temelleri, deoksiribonükleotid trifosfatların, bir DNA şablon zincirine dâhil edilmesini katalize eden DNA polimerazından oluşur. Her döngü sırasında, birleşme noktasında nükleotidler, florofor uyarımı ile tanımlanır. Kritik fark, tek bir DNA parçasını dizilemek yerine, NGS’nin bu süreci milyonlarca parçaya büyük ölçüde paralel bir şekilde genişletmesidir.
Yeni Nesil Dizileme (NGS- Next-Generation Sequencing) Nedir?NGS analizi, allellerin aynı büyüklükte olduğu durumlarda DNA’daki nükleotidlerin sırasındaki farklılıkları bulmaya izin verir. Aynı zamanda, tek bir iş akışında birden fazla polimorfizmi aynı anda analiz etmeye olanak tanır. NGS, tekrar uzunluğuna ek olarak önemli dizi varyasyonunu ortaya çıkarır. Böylece geleneksel fragman analizine kıyasla STR’lerin ayırt edici gücünü arttırır. Ve aynı zamanda ciddi şekilde bozulmuş DNA söz konusu olduğunda büyük SNP panellerinin analizine de olanak tanır. Öte yandan, NGS’deki çoklu analizlerden elde edilen bilgilere tüm adli vakalarda ihtiyaç duyulmaz. Sıralama kapasitesinin büyük bölümlerini alabilir, bu da sonuç olarak sıralama çalışması başına daha az örnek ve daha yüksek araştırma maliyeti ile sonuçlanır. Deneyimlere göre, kitaplıkların boyutlandırılması ve miktarının belirlenmesi için güvenilir bir kalite kontrol platformu gereklidir.
NGS, biyolojik kanıtlarda bulunan mikroorganizmaların, cinsel yolla bulaşan enfeksiyonların tespiti ve ölüm sonrası aralığı (PMI) tahmin etmek amacıyla da kullanılabilir. NGS, genomun her temelini analiz ederek tespit edilen polimorfizmlerin hızlı tüm genom tiplemesine uygun hale getirir. Böylece adli verilere daha yüksek çözünürlük ve daha fazla doğruluk sağlayan yüksek verim ve çoğullama yeteneği ve doğruluğu avantajına sahiptir. Kadavra ve toprak ara yüzündeki edafik, nekrobiyomik mikroorganizmalar, konakçı vücut öldüğünde ve ayrışmaya başladığında değişen çok tür toplulukları oluşturur. Bu dinamik değişikliklerin karakterizasyonu, metagenomik teknolojilerle mümkün kılınmıştır. Yüksek kaliteli bir adli mikrobiyal veritabanının yakında bir gerçeklik haline gelmesi, suçluların ve biyolojik teröristlerin hızlı ve doğru bir şekilde tanımlanmasına yardımcı olması bekleniyor.
İnsan dışı türlerin belirlenmesi bile adli tıp uygulamasının önemli bir bileşenidir. Entomolojik kanıt, PMI’yi tanımlamak için kullanılır. Esasen böceğin morfolojik olarak tanınmasına ve böcek yaşam döngüsü aşamasının bir tahminine dayanır. Ancak moleküler genotipleme yöntemleri, sindirim sistemlerinde türlerin veya insan genetik materyalinin tanımlanması gerektiğinde adli entomolojik araştırmalar için önemli bir destek sağlayabilir. NGS teknolojisine dayalı epigenetik yaklaşımlar, tüm genom bisülfit dizileme ve metillenmiş DNA dizilemesini içerir.
İlginç bir şekilde, düşük miktarlarda başlangıç DNA’sı (100 pg), kantitatif metilasyon saptaması yoluyla başarıyla analiz edilmiştir. Ek olarak, başka bir cesaret verici çalışma, mikro hacimli kan lekesi örnekleri ile bisülfit genomik DNA dizilimi gerçekleştirmiştir. Bu aynı zamanda doku tipini, hastalıklarla ilişkileri tahmin etmek, bir DNA donörünün cinsiyetini ve yaşını belirlemek için de kullanılabilir. Dahası, tek yumurta ikizlerini ayırt etmek, aynı STR profilleri sergiledikleri için adli genetikte bir sınırlama olmuştur. NGS’ye ulaşabilen tek bir dizinin yüksek sayıdaki okumaları, metillenmiş DNA ve mitokondriyal SNP’lerin varyasyonlarını görmeyi sağlayarak, onları ayırt edilmesi için bir yol sağlar.
MikroRNA’lar adli bilime ancak yakın zamanda tanıtılmıştır. Uzunlukları 18–24 nükleotid olan endojen küçük RNA molekülleri sınıfıdır. Orada küçük boyut, bozunmaya karşı direnç ve dokuya özgü veya yüksek düzeyde doku farklı ifade, birçok hücresel süreç için temel bir düzenleyici rol oynar. Bir DNA profilini belirli bir vücut sıvısına, tür tanımlamasına, farklı hastalık durumlarına ve adli vücut sıvısı tanımlanması için uygundurlar. Adli bilimlerde NGS teknolojisi, ceza davalarının çözümüne katkı sağlayan uygulama alanını artırır. Laboratuvarlar arasında prosedürlerin standartlaştırılması, mahkeme önünde kabul edilmesinin yanı sıra kullanımlarının ve sınırlamalarının anlaşılmasına yol açar.

Soy ve Fenotipik İfade

İnsanlar DNA’larında % 99,9 özdeştir ve her insan genomu arasındaki fark küçüktür. Yine de, bu küçük farklılıklar analiz edilirken, neyin benzersiz kıldığını anlamaya yardımcı olur. İnsan genomları arasındaki varyasyon, dünya çapında rastgele dağılmamıştır. İnsanların yakınlarda yaşayan insanlarla birlikte torunları olma olasılığı daha yüksektir. Coğrafi olarak iki birey veya popülasyon ne kadar yakınsa, genetik olarak o kadar benzer olma eğilimindedir. Popülasyona özgü aleller hem STR hem de SNP belirteçlerinde bulunmuştur. İnsan popülasyonu varyasyonunun genetik örüntüleri, bir dizi ardışık göç ve darboğaz olayından ortaya çıkmıştır.

Yeni Nesil Dizileme (NGS- Next-Generation Sequencing) Nedir?Ataların Genetik Belirteçlerinin Analizi

SNP’ler, daha düşük mutasyon oranları nedeniyle STR’lere göre bir popülasyonda sabitlenmeye daha uygundur. SNP’ler her yüz nesilde bir sırayla değişirken, STR mutasyon oranları yaklaşık olarak binde birdir. Soy bilgilendirici belirteçleri (AIM’ler), ayırt etmeye yardımcı olabilecek büyük frekans farklılıklarına sahip alellere sahiptir. SNP varyantlarının küçük bir kısmı, atalar için özellikle bilgilendirici olarak ortaya çıkmıştır. Ve onları çeşitli popülasyonlarındaki varyasyon modelleriyle karşılaştırıştır. Uygun soy bilgilendirici belirteçleri seçerken, popülasyonlar arasındaki ıraksama derecesi ve bir testin farklılaştırmaya çalıştığı popülasyonların sayısı, hem seçim sürecini etkiler.
Soy çıkarımı, bağlantılı profillerdeki ek verilerle soğuk vaka incelemelerine yardımcı olmak dahil birçok başka uygulama sunar. Kayıp kişilerin veya afet kurbanlarının daha eksiksiz bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Ayrıca karışık ebeveynli bireylerde fiziksel özelliklerin atipik kombinasyonlarının değerlendirir. Ve adli duyarlılığın gerekli olduğu durumlarda, örneğin tıbbi arşiv materyalinin veya arkeolojik DNA’nın test edilmesi gibi genetik çalışmaların güçlendirilmesinde kullanılır. Ancak AIM’ler, örneklerin atalarından kalma geçmişini tahmin etmek için % 100 doğru değildir. örneğin, karışık atalara sahip bireyler beklenen fenotipik özelliklere sahip olmayabilir. Bu nedenle, genetik testlerden elde edilen sonuçlar her zaman dikkatle ve yalnızca güvenilir kanıtlar bağlamında yorumlanmalıdır.
Nüfusun hareketinin daha yoğun olduğu ülkelerde, daha yüksek seviyelerde karışım beklenmektedir. Bu nedenle genetik test sonuçlarının coğrafi konumla güçlü bir şekilde ilişkilendirilmesi olası değildir. Bununla birlikte, eklenmiş soy olasılığı, herhangi bir AIM paneli ile herhangi bir istatistiğin kullanımında bir uyarı uyandırır. Atalara ait popülasyonlar referans popülasyonlar arasında temsil edilmedikçe, karışık soy tam olarak tahmin edilemez. AIM’ler sınırlıdır, optimum SNP’lerin tanımlanması örnek grupları arasında değişebilir. Bazı paneller çok fazla sayıda SNP’ye dayanır ve bu nedenle diğerlerinin farklı popülasyonları test etme kabiliyetini sınırlar. Suç mahallinin adli genetik araştırmalarındaki amaçlar, 1 ng’den daha küçük çok küçük miktarlarda DNA üzerinde gerçekleştirilebilir. AIM incelemelerinin sonucunun yorumlanması için strateji açıklayıcı olabilir. Çeşitli popülasyonlarda AIM profillerinin olasılığı hesaplanabilir. En yüksek olasılığa sahip olan, menşe popülasyonu olarak kabul edilebilir. Önceden iki popülasyon belirlendiğinde, popülasyonların olasılık oranları hesaplanır.
Bir popülasyonun diğerinden daha büyük olma olasılığı, iki popülasyondan herhangi birinin AIM profiliyle ilgili olduğunu kanıtlamaz. Çünkü popülasyonlar münhasır olsa bile, olası tüm insanları kapsayacak şekilde kapsamlı değildirler. Sürekli geçişler nedeniyle, AIM alelleri tüm insan grupları arasında paylaşılır. Bir alelin mutlak varlığı veya yokluğu değil, daha ziyade, ata çıkarılırken genellikle analiz edilen popülasyondaki sıklığıdır. Otozomal markörlerin rekombinasyonu, bir bireyin karıştırılmış doğası hakkında ek bilgi sağlayabilir. Y kromozom belirteçleri ve mitokondriyal DNA (mtDNA) sekans varyasyonunun, anne ve baba soyları ile ilgili ata çıkarımları için yararları ve sınırlamaları vardır. INDEL’ler de değerli AIM’ler olabilir, ancak belirteçlerin sayısı ve bilgilendirici değer SNP’lerinkinden daha azdır.

Fenotipik İfadenin Genetik Belirteçlerinin Analizi

Adli fenotipleme, kanıt niteliğindeki bir numunenin vericisinin soyuna ve harici olarak görünür özelliklerine (EVC’ler) ilişkin yararlı bilgiler sağlayabilir. Günümüzde, SNP’ler harici olarak görünür özelliklerin temel çıkarımını yapmaktadır. Failin DNA’sının mevcut olduğu ancak şüpheli tanımlanmadığı durumlarda, tanımların mevcut olmadığı veya belirsiz olduğu durumlarda bu, görgü tanığının ifadesinin yerini alabilir ve destekleyebilir.
DNA genotiplerinden EVC’lerin tahmin fenotiplerinin nihai amacı, bilinmeyen kişileri bulmak için polis araştırmalarını yardımcı olmaktır. Mahkeme salonu kullanımı için DNA’nın bireyselleştirilmesinde, veri tabanı eşleşmeleri olmadan düşük miktarda DNA mevcutsa, standart adli STR profillemesini (DNA parçaları) yalnızca hedeflenen EVC eşleşen şüphelilerin sayısının azalması için faydalı olabilir. Bir bireyin fiziksel görünümünü doğrudan olay yeri materyalinden tahmin etme yeteneği, prensip olarak STR profillemenin DNA (profil) veritabanında bir isabet sağlayamadığı durumlarda, bilinmeyen faillerin dahil olduğu çok sayıda potansiyel şüpheliyi sınırlandırır. Böylelikle polis soruşturmalarına yardımcı olabilir. Bu ya da yetkililer tarafından seçilen bir şüpheli ile bir eşleşme sağlayamadığında veya mevcut DNA’nın düşük kalitesi miktarı nedeniyle bir STR profilinin oluşturulamadığı durumlarda geçerlidir.
Tanımlanamayan bir cismin, EVC’lerin insan tanımlama için yol göstermesi beklenir. Bununla birlikte, cilt rengi, saç rengi, vücut boyu, erkek kelliği ve saç morfolojisi gibi diğer DNA belirteçlerini belirlemek için hala çalışmalar yapılmaktadır. Çok sayıda küresel çalışma, popülasyonun coğrafi dağılımı ile cilt, saç ve iris pigmentasyonu, biyolojik metabolizma, biyolojik modifikasyon varyantları tanımlar. Ayrıca, hastalığa duyarlılık ve morfoloji dahil olmak üzere çeşitli insan fenotiplerine bağlı alel frekanslarındaki varyasyonlar arasındaki korelasyonları tanımlar. Çünkü bu varyasyonlar büyük nüfus çeşitliliği göstermesi bekleniyor. Araştırmacılar, DNA sonuçlarını kullanarak soydan gelen olasılıkları veya fenotip tahminlerini anlamakta güçlük çekebilirler.

Yeni Nesil Dizileme (NGS- Next-Generation Sequencing) Nedir?Genetik DNA Veritabanı

Adli genetik, bir şüpheliyi onaylama veya ortadan kaldırma yeteneği açısından birçok ceza ve hukuk yargılamasında kilit bir test haline gelmiştir. Suç alanında, suç stratejilerinin analiz edilmesine ve belirlenmesine, adli ve polis yönetiminin iyileştirilmesine olanak tanır. DNA veritabanları, şüphelilerin veya hükümlülerin ve bazen mağdurların otomatik olarak karşılaştırılmasına olanak tanıyan ceza davalarının çözümünü takip eder.
Bu tür bir veritabanının yararlılığı, mevcut olduğu tüm ülkelerde tartışılmazdır. Her ülkenin mevzuatı, bu konuları etkileyen belirli noktalarda farklılık göstermektedir. Bir diğer önemli nokta, hangi laboratuvarların veri tabanına dahil edilen DNA profilleri üretebileceğini belirlemektir. Yakın gelecekte, gelişmiş ülkelerin, bazı suçlarla mücadelede temel bir araç olabilecek genetik verilerin değişimi için işbirliği anlaşmaları yapması muhtemeldir. Kamu kurumlarının bu veritabanlarının kapsamını bilmeleri, cezai soruşturma amacıyla bilgi alışverişi ve harmanlama için işbirliği anlaşmaları oluşturmaları önemlidir.

Kaynakça:
europepmc.org/articles/pmc4637504
scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-31802002000300004

Yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu

Cevap bırakın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak.

Bu web sitesi deneyiminizi geliştirmek için çerezleri kullanır. Bununla iyi olduğunuzu varsayacağız, ancak isterseniz vazgeçebilirsiniz. Kabul etmek Mesajları Oku