Mevcut birçok ekstraksiyon yöntemi vardır ve bunlar DNA’yı verimli bir şekilde ekstrakte etme yetenekleri açısından farklılık gösterir. Dikkate alınacak faktörlerden bazıları, analiz edilecek numunenin türü, işlenmesi için gereken süre, operatör müdahalesi, kontaminasyon riski ve kullanım zorluğu veya kolaylığıdır. Bu, başarılı adli DNA profillemesinin temelidir. Tercih yönteminin görevi sadece DNA’nın her bir örnekten verimli bir şekilde ekstrakte edilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda amplifikasyon gibi diğer süreçlere müdahale edebilecek olası inhibitörleri de ortadan kaldırmalıdır.
![DNA Ekstraksiyon Yöntemleri]()
DNA Ekstraksiyonu İçin Teknikler
DNA Ekstraksiyonu İçin TekniklerDNA ekstraksiyonunda kullanılan en yaygın tekniklerden biri, DNA’yı bozulmadan koruyan geçiş metal iyonlarını bağlamak için iyon değişimini kullanan bir kenetleme reçinesi olan Chelex’tir. Chelex yönteminin avantajı hızlı olması, çoklu tüp transferleri gerektirmemesi ve toksik organik çözücüler kullanmamasıdır. Ana dezavantajı, amplifikasyon sürecine müdahale eden inhibitörleri çıkaramamasıdır. İnhibitörlü numuneleri işlerken, proteinleri denatüre etmek ve DNA’yı hücreden serbest bırakmak için deterjanlar ve proteazlar içeren bir tuz solüsyonu kullanılır. Bu tuzlu suda gerçekleştirilen hücrelerin parçalanmasını gerektiren organik ekstraksiyon yönteminin kullanılması tavsiye edilir.
Bu kokteyl, DNA’yı sulu fazda bırakan bir fenol-kloroform-izoamil alkol karışımı kullanılarak ayrılabilir. Ekstrakte edilen DNA sulu fazdan etanol çökeltme yoluyla veya numunelerde DNA’nın ilave saflaştırılmasına ve konsantrasyonuna izin veren bir santrifüjlü filtre ünitesi ile konsantre edilebilir. Organik ekstraksiyon yönteminin avantajı, zor örneklerden (bozulmuş ve / veya düşük miktarda DNA) genetik materyal elde edebilmesidir. Ayrıca PCR için inhibitörlerin varlığını başarılı bir şekilde ortadan kaldırabilmesidir. Bu yöntem en güvenilir ve verimli yöntemlerden biri olmaya devam ederken, aynı zamanda çok zaman alıcıdır. Tehlikeli kimyasallar kullanır ve daha fazla uygulamalı çaba ve dahil olan çoklu tüp transferleri nedeniyle kontaminasyon ve numunelerin hatalı kullanımı için artan riskler ortaya çıkarır.
DNA Karışımlarında Diferansiyel Liziz
Cinsel suçlarda toplanan kanıtların genetik analizi genellikle iki veya daha fazla katılımcının genetik profillerini içerir. Bu tür karışımlarda, bireylerin genetik katkısı genellikle dengesizdir. Bazı durumlarda, biyolojik karışım asgari düzeyde bir katkıda bulunur, genellikle cinsel saldırı vakalarında faildir. Bu donörün genetik oranı, duyarlılık sınırları veya daha fazla miktara sahip bileşen tarafından reaksiyon doygunluğu nedeniyle muhtemelen tespit edilmez. Çoğu durumda, oranlar 1: 20’yi aştığında, DNA karışımındaki minör katkı tespit edilemez.
Cinsel saldırı vakalarında kanıtların elde edilmesi, DNA adli tıp analistleri için büyük bir zorluktur. Çünkü DNA’nın epitel (kurban) ve sperm (fail) hücrelerinden ayrılmasını gerektirir. Diferansiyel ekstraksiyon ilk olarak 1986 yılında Gill ve ekibi tarafından organik fenol-kloroform ekstraksiyonunun bir modifikasyonu olarak tanımlanmıştır. Ve buna diferansiyel lizis adı verilir çünkü sperm dışı hücreler deterjan ve proteazlarla seçici olarak parçalanır. Sperm ise sperm başındaki proteaz tedavisine direnen ağır disülfit çapraz bağlı proteinler nedeniyle hücreler parçalanmaz. DNA adli tıp laboratuvarlarında, diferansiyel lizis yöntemi, spermatozoayı epitel hücrelerinden ayırmak için uzun süredir standart olmuştur. Bu teknik teorik olarak daha önce belirtildiği gibi teorik olarak iki fraksiyon sağlayabilse de, ayrılma her zaman tamamlanmayarak karışık genotiplerle sonuçlanır.
Diğer DNA Ekstraksiyon Yöntemleri
Sperm ve epitel hücrelerini cinsel saldırı örneklerinden ayırmanın başka yöntemleri de vardır. Differex ™ sistem yöntemi, epitel hücrelerinin proteinaz K-seçici sindirimini, ardından diferansiyel santrifüjlemeyi ve faz ayrılmasını içerir. Bu yöntemin DNA laboratuvarlarında kullanılması, karışık lekelerden sperm DNA’sının çıkarılması için iki aşamalı yönteme eşit verimlilik sunduğunu göstermektedir.
İnsan Tanımlama İçin Moleküler Yöntemler
Adli bir ortamda DNA testinin ilk kullanımı 1986’da olmuştur. İngiltere’de Leicestershire’da iki kız çocuğu cinsel saldırıya uğramıştır, ardından 1983 ve 1986’da vahşice öldürülmüştür. Bu dava bir masumun suçlandığını ve 1 yıl sonra suçlu suçlunun bulunup işlendiğini göstermiştir. Son 30 yılda, DNA moleküler analizi adli araştırmalarda önemli bir araç haline gelmiştir. Günümüzde, DNA profili, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) analizlerine dayanmaktadır. Bu yöntem, otozomal STR’leri, Y ve X kromozomlarını içerir. PCR, bir bölgenin birçok kopyasını elde etmek için genom üzerindeki belirli bir bölgeyi defalarca çoğaltma işlemidir.
PCR’den önce DNA’nın ölçülmesi gerekir ve bu doğru amplifikasyonunu sağlamak için bu çok önemlidir. Birincil amacı, izolasyondan kaynaklanan DNA şablonunun miktarını belirlemektir. Farklı doğrulukta birçok yöntem vardır, ancak örneklerde bulunan DNA konsantrasyonunu bilmek, adli tıp bilimcisinin, kalan bir genetik profil elde etmeyi mümkün kılmak amplifikasyonu için gereken ideal DNA miktarını oluşturmasına izin verir. Cinsel suçlarda toplanan kanıtların genetik analizi genellikle iki veya daha fazla katılımcının genetik profillerini içerir. Bu tür karışımlarda, bireylerin genetik katkısı genellikle dengesizdir. Bu, muhtemelen PCR’yi etkilediği bilinen tercihli amplifikasyon gibi bir dizi stokastik etki yoluyla tanımlama sürecini daha çook bozar.
Kısa Tandem Tekrar (STR) Analizi
Mikro uydular veya STR’ler, art arda tekrarlanan bir nükleotid çekirdeği içerir ve adli bilimlerde kullanımları insan tanımlamasında yeni bir yol açmıştır. STR’lerin, aşırı değişken belirteçleri nedeniyle yüksek derecede ayrımcılığa sahip oldukları iyi bilinmektedir. Bu, failin suç mahalline veya mağdura dahil edilmesi amaçlandığında yararlıdır. Artefaktlar, adli vakalarda sık karşılaşılan bir sorundur. Biyolojik olanlar ve enstrümantal olanlar, eksiksiz ve doğru bir STR profili oluşturmak için genellikle sıralanmalıdır. Parçalanmış DNA’yı gösteren biyolojik kanıtlar genellikle cinsel saldırı vakalarında bulunur. Ve PCR ürünleri daha küçük olduğunda daha etkili bir şekilde geri kazanılabilir. PCR primerlerini STR bölgesine yaklaştırarak, aynı bilgiler korunurken ürün boyutları azaltılabilir. Uygulamada, tehlikeye atılmış DNA örneklerinden bilgilerin kurtarılmasındaki başarı oranları, geleneksel STR kitlerine kıyasla mini STR sistemleriyle artar.
Cinsiyet kromozomal STR, bir kişinin biyolojik soyunu gösterir ve akrabalar arasında düşük bir dışlama gücü elde eder. Y-STR belirteçleri, farklı ekstraksiyonun mümkün olmadığı durumlarda, azospermik bir erkekte veya yaşlı cinsel lekelerde karşı cinsten karışık profiller söz konusu olduğunda rol oynayabilir . X-STR markörleri çok çeşitli adli uygulamalara sahiptir, teyze, yeğen ve kuzenler gibi akrabalar arasındaki ilişkiyi kurmak için kullanılabilir. Ayrıca, teorik ve ilk ampirik kanıt, 13 RM Y-STR setinin (hızla değişen Y-STR’ler) erkek göreceli farklılaşmadan daha yüksek bir büyüklük sırasına ulaşabildiğini göstermek için sağlanmıştır. Bu neredeyse tamamlanmış erkek bireyselleşmesinin etkileri, adli tıp uygulamalarında büyük fayda sağlar. Örneğin, adventif haplotip eşleşmeleri nedeniyle masum bireylerin cinsel araştırmalara dahil edilmesini azaltmak için kullanılabilir.
Tek Nükleotid Polimorfizmleri (SNP’ler) Analizi
SNP’ler, belirli bir noktada bireyler arasında tek bazlı bir dizi varyasyonudur ve insan genomundaki milyonlarca bölgede yer alır. Bu da bireyleri birbirinden ayırt edebilecekleri anlamına gelir. SNP’ler, stokastik fenomen göstermeyen bozulmuş DNA örneklerinden bilgileri kurtarabilir. Örnek işleme ve veri analizi daha otomatik hale getirilebilir çünkü boyuta dayalı bir ayrıma gerek yoktur. Ayrıca etnik köken ve belirli fiziksel özellikleri tahmin etme yeteneğine sahiptir. Adli DNA tipleme uygulamalarında SNP’leri kullanmanın en büyük zorluklarından biri, küçük miktarlarda DNA’dan sağlam PCR multiplekslerinde yeterli sayıda SNP’yi aynı anda amplifiye edememektir.
Tek bir SNP, çok alelik bir STR işaretleyiciden daha az bilgi verdiğinden,makul bir ayrım gücü elde etmek için daha fazla sayıda SNP’yi analiz edilmeis gerekir. Eskiden, yüksek yoğunluklu SNP dizileri, yüz binlerce hatta milyonlarca SNP’nin paralel olarak analiz edilmesine izin vermiştir. SNP dizisinin temel ilkeleri, DNA hibridizasyonunun yakınsaması, floresan mikroskobu ve katı yüzey DNA yakalamadır. SNP dizilerinin üç zorunlu bileşeni, hareketsizleştirilmiş alele özgü oligonükleotid (ASO) probları içeren bir dizidir. Floresan boyalarla etiketlenmiş, hedefin parçalanmış nükleik asit dizileri, hibridizasyon sinyalini kaydeden ve yorumlayan bir tespit sistemidir. Bununla birlikte, bu diziler tipik olarak yüzlerce nanogram DNA gerektirir. Bunlar genellikle küçük biyolojik lekelerden kaynaklanan adli vaka örneklerinden elde edilememektedir. Ayrıca bu nedenle ata çalışmalarında daha sık kullanılmaktadır.
Bir bialelik veya di-alelik polimorfizmin başka bir formu, nükleotidlerin veya bir DNA segmenti olabilen INDEL’in sokulması-silinmesidir. Çoğu INDEL, birkaç nükleotid uzunluk farklılığından oluşan alel sergiler. PCR amplikonları 160 bp’den daha az olacak şekilde tasarlanmıştır ve bununla yaklaşık 300 pg DNA şablonuna kadar tam bir profil elde edilebilmiştir. Bununla birlikte, tüm INDEL’ler tüm popülasyonlarda oldukça bilgilendirici değildir ve insan genomundaki INDEL’lerin tam sayısı bilinmemektedir.
Hem SNP’ler hem de INDEL’ler artık tüm rutin adli tıp laboratuvarlarında bulunan cihazlarda parça uzunluğu analizine dayalı multipleksler kullanılarak tiplendirilebilir. Böylece markör aralığını kullanılan STR’lerin ötesine genişletmeyi mümkün kılar. Son yıllarda, çok sayıda SNP’ye dayalı haplotip sistemleri, analiz için güçlü bir alternatif sağlayan STR’lerinkine yakın ayırt edici güçleri nedeniyle adli alan için optimal belirteçler olarak denenmektedir. Mikrohaplotipler (MH’ler), 200 nükleotidden daha az bir aralıkta 2 veya daha fazla SNP’ye sahiptir. Son derece düşük rekombinasyon oranları, parçalanmış DNA ve karışım örnek analizi olan durumlarda faydalı STR’lere benzer ayırt etme gücü vardır.
Mitokondriyal DNA Analizi
Mitokondriyal DNA (mtDNA) analizi genellikle Sanger dizileme kimyası kullanılarak yapılır. Bu DNA sıralaması, hem ileri hem de ters yönde gerçekleştirilir. Böylece tamamlayıcı iplikler, kalite kontrol amacıyla birbirleriyle karşılaştırılabilir. Bugüne kadarki çoğu adli DNA çalışmasının odak noktası, kontrol bölgesinde genellikle HVI (HV1) ve HVII (HV2) olarak adlandırılan iki hiper değişken bölgeyi içermektedir. Zaman zaman kontrol bölgesinin HV3 olarak bilinen üçüncü bir kısmı, test edilen bir örnekle ilgili daha fazla bilgi sağlamak için incelenir. İnsan mitokondriyal DNA’sının kesinlikle annelerden miras kaldığı düşünülür ve genellikle ebeveyn bağlarında kullanılır.
Ortadaki sperm hücresi parçası mtDNA içerir ve bu DNA otozomal DNA’dan daha dirençlidir. Çünkü küçük dairesel genomlarda, mitokondrinin çift zarı ve dairesel yapı bozulma süreçlerine karşı koruyucu ajanlar olarak işlev görür. MtDNA için adli tıp uygulamaları, bozulmuş veya düşük miktarda DNA içeren örneklerin analizini içerir. Ve bu, Çar II. Nicholas ve kardeşi Georgij Romanov’un kimliğinin belirlenmesi için kullanılmıştır . Fiziksel ayırmanın yanı sıra, kadının mtDNA’sının birlikte amplifiye edilmemesini sağlamak için erkek için sekansa özgü primerler (SSP) kullanılmıştır. Primer tasarımı, bukkal sürüntülerin mtDNA analizinden sonra belirlenen katılımcılar arasındaki mtDNA haplotip farklılıklarına dayanmaktadır. Bu prosedür, bir vajinal çubukta bulunan tek bir sperm hücresinden erkek mitotipinin karakterizasyonuna olanak tanır ve tanımlanmasında kullanılmıştır. Yakın zamanda yapılan yaklaşımda mtDNA’nın mikromanipülasyon tekniği ile vajinal kanaldaki sperm hücrelerinin tanımlanmasında kullanılabileceği gösterilmiştir.
Kaynakça:
europepmc.org/articles/pmc4637504
scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-31802002000300004
Yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu