Dolaylı Somatik Embriyogenez Modeli

Somatik embriyogenez, C. arabica ve C. canephora kahve türlerine, transgenik bitkiler elde etmek için seçkin çeşitlerin vejetatif çoğaltılması için bir uygulama modelidir. Bu büyük ölçekli klonal kültivar, Arabica F1 hibrid amacıyla ve ayrıca bitki farklılaştırma çalışma modeli olarak uygulanır. Ek olarak, klonlama, araştırma kurumları arasında değişim için in vitro germplazma kültivarları stokuna ve materyallerin korunmasına izin verir, çünkü bu türün tohumları bir dereceye kadar inatçıdır. C. arabica somatik embriyo oluşumu dolaylı yoluyla elde edilebilir. Dolaylı somatik embriyojenez kallojenez, ardından embriyojenez iki aşamada meydana gelir. Öte yandan, doğrudan somatik embriyogenez, callogenesis olmaksızın tek bir aşamada meydana gelir. Bu iki embriyogenez formu arasındaki karşılaştırma, doğrudan yolun dolaylı yoldan daha avantajlı olduğunu gösterir.
Tek bir aşamada meydana gelen doğrudan yol, girdileri, işçiliği ve yetiştirme süresini azaltırken, dolaylı yol, somatik embriyo üretmenin daha yüksek maliyetli olduğu iki aşamada ortaya çıkar. Ancak doğrudan yolun daha avantajlı olmasına rağmen, çoğu çalışma, C. arabica genotiplerinin vejetatif çoğalmasının esas olarak dolaylı somatik embriyogenez ile sağlandığını göstermektedir. Dolaylı yolda, bu türün eksplantları daha kolay ve yüksek miktarda embriyo üretirken, direkt yolda oluşan embriyo sayısı daha azdır ve bu süreç uzun sürede gerçekleşir. Çalışmalar, C. arabica genotiplerinde doğrudan yolun oluşmasının zorluğunun eksplant dokusunun kendisi tarafından üretilen maddelerin varlığıyla ilişkili göründüğünü göstermiştir. Bu, C. canephora ve Daucos carota eksplantlarında gösterilmiştir. C. arabica eksplantları tarafından salgılanan maddelerin ilavesiyle kültür ortamında kültive edildiklerinde doğrudan yolun inhibisyonunu gösterir. Bu sonuç muhtemelen C. arabica genotiplerinde doğrudan yolun oluşmasının zorluğu ile ilgilidir.
Somatik embriyogenez yoluyla kahve rejenerasyonu, anterler, yapraklar ve kökler gibi farklı eksplant türlerinden elde edilebilir. Bununla birlikte, yaprak eksplantasyonu, C. arabica genotiplerinde doğrudan veya dolaylı somatik embriyogenezin uygulanması için en çok kullanılan türdür. Kahve somatik embriyogenezinin, in vitro fidelerden yaprak eksplantlarına uygulandığında, doğal ortamdaki bitkilerden toplanan yapraklardan daha etkili olduğuna dair göstergeler vardır ve bu yanıt, endojen bitkisel hormonlarla ilişkili olmalıdır. Bu bakış açısı morfoloji ile de ilgili olabilir çünkü in vitro fide yaprakları çevresel bitkilerden elde edilenlere göre daha kalın bir kütiküler tabakaya sahiptir. Bu özellik, somatik embriyogenez yanıtının etkinliğine yol açan kültür ortamı bileşenlerinin daha fazla emilmesini destekleme eğilimindedir. Ayrıca kahve çevresel bitkilerden gelen yaprak eksplantları kıvrılabilir ve bu da kültür ortamından besin emilimini bozar.
C. arabica eksplantları, kültür ortamında aşılamadan yaklaşık 60 gün sonrasına kadar yeşil kalır ve bu süreden sonra oksitlenir. Bu yanıt, doğrudan veya dolaylı yoldan gönderilen eksplantlarda doğrulanır. Genel olarak, oksitlenmiş eksplantlar yaşlanmış görünmelerine rağmen kahve çekirdeği veya embriyo oluşturma kabiliyetine de sahiptir. Dolaylı yolda, C. arabica’nın somatik embriyoları, kültür ortamında yaklaşık 210 günlük eksplant inokülasyonundan sonra oluşurken, doğrudan yolda yaklaşık 90 gün sonra, ancak küçük sayılarda gözlemlenebilirler. Öte yandan, bu iki embriyogenez yoluna gönderildiğinde somatik embriyo oluşturmayan ve buna dirençli olarak adlandırılan genotipler de vardır. C. arabica çeşidi Mundo Novo’nun yaprak eksplantları her iki yolda da somatik embriyolar oluşturur. Ancak aynı genotip, bu yolların her birinde somatik embriyogenez için farklı kapasiteye sahip olabilir. Mundo novo kültivarının ve kafeinsiz genotip AC1, AC2 ve AC3’ün eksplantları, dolaylı yoldan, doğrudan olana göre daha fazla sayıda somatik embriyo oluşturmuştur.

Dolaylı Somatik Embriyogenez Nedir?

Elde edilen kahve, dolaylı somatik embriyojenez somatik embriyoların oluşumuna karşılık ilk callogenesis embriyojenez iki aşamada gerçekleşir. Bu türdeki dolaylı somatik embriyojenezin bir başka özelliği, kallusun in vitro olarak uzun süre kalması nedeniyle klonlanmış bitkilerde somaklonal varyasyonun ortaya çıkmasıdır. Somaklonal varyasyon, bitki büyümesini ve gelişimini tehlikeye atabilen mutantların oluşumuna yol açtığı için tercih edilmez. Öte yandan, kahve yetiştirme programına dâhil edilebilecek genetik değişkenliğe sahip genotipler elde etmek için ortaya çıkması tercih edilir. Eksplant mutasyonlarının indüksiyonu için yüksek konsantrasyonlarda 2,4 D yetiştirilir. Çoğu çalışma, C. Arabica genotiplerinde dolaylı somatik embriyogenezin uygulanması için sondhal ve sharp protokolünü kullanmışlardır. Bunlar genellikle düşük rejeneratif kapasiteye sahip olduklarında bile bazı somatik embriyo üretimi ile yanıt verirler.

Kallojenez

İçinde callogenesis indüksiyonu için Kahve genel olarak genotip MS ortamında ile protokol ve phytoregulators ilave 2,4 D ve kinetin ve 30 g / L sukroz kullanılır. Bu aşamada, oksin 2,4 D yüksek konsantrasyonda kullanılır ve hücre bölünmesine yol açan eksplant dokusunun endojen oksin metabolizmasında bozulmaya neden olur. Çoğu türde kalojenez elde etmek için oksin stresi gereklidir. Böylece, kallojenezin indüksiyonunda, eksplant dokusunun farklılaşmış somatik hücreleri, işlevsel olmayan bir hücre kütlesi olan kallusu oluşturan hücre bölünmesi ve proliferasyon olaylarının meydana gelmesi ile yeniden belirlemeye tabi tutulur. Ama aynı zamanda calogenesis indüksiyonu olduğu bulunmuştur. Kahve örneğin NAA gibi oksin tiplerinin kullanımına karşılık olarak elde edilebilir ve pikloram.
Sakaroz, kalojenezin indüksiyonu için enerji sağlamak üzere yüksek konsantrasyonda kullanılır. C. Arabica eksplantlarındaki biyokimyasal analizler, kalojenez fazında yüksek konsantrasyonda çözünür şekerlerin oluştuğunu, somatik embriyoların oluşumunda ve olgunlaşmasında ise daha düşük olduğunu göstermiştir. Dolaylı yolda, C. Arabica yaprak eksplantları, kültivasyonun başlamasından sonraki yedinci gün civarında procambium hücrelerinden kallus oluşumunu başlatır. Genelde ekimin 14. gününden itibaren 3 mm’ye kadar ulaşan eksplantların kenarlarında küçük kahve çekirdeği oluşumunu görmek mümkündür. Bu çekirdekler genellikle eksplantın yalnızca bir veya iki tarafında oluşur ve daha sonra eksplantın dörtkenarını kaplayabilecek boyutlara ulaşır.
Erken gelişimde kahve çekirdekleri hiyalindir, ancak yavaş yavaş okside olma eğilimindedirler. Dolaylı yollara maruz kalan aynı menşeli bir dizi eksplantta, gelişmeyen çekirdekleri bulmak mümkündür ve 5 mm’ye kadar küçük kalırlar. Bununla birlikte, bu çekirdeklerden bazıları somatik embriyo oluşturma kapasitesine sahiptir, bu da bu süre zarfında gizli göründüklerini gösterir. Ayrıca, tüm C. arabica eksplantlarının, aynı bitkiden veya aynı yapraktan gelen eksplantlar arasında somatik embriyojenik kapasitenin değişebileceğini gösteren kallus oluşturmadığı da not edilmelidir. Kallus C. arabica yetiştirme başına 90-120 gün, yaklaşık 30 mm boyutlarına kadar ulaşabilir. Bu dönemde kahve çekirdekler de oksitlenebilir. Eksplantların ve kallusun oksidasyonu, bu türün dokularında bulunan yüksek fenol içeriği ile ilişkilidir. Ayrıca, normal olarak oksitlenmiş kallusların, yaşlanma görünümüne sahip olmalarına rağmen somatik embriyo oluşturma kapasitesine sahip oldukları da gözlenmiştir.

Embriyogenez, Embriyo İndüksiyonu

Dolaylı yolun ikinci aşaması için, Sondhal ve Sharp’ın protokolüne göre NAA ve kinetin eklenmiş ve 20 g / L sükroz ile MS / 2 ortamı kullanılır. Amaç calli, kalojenez indüksiyon ortamından embriyojenez ortamına aktarılır. Bu aşamada, embriyojenik merkezlere karşılık gelen, kallusun bazı sektörlerinde yer alan belirli hücrelerden somatik embriyoların başlaması ve gelişmesi söz konusudur. Somatik embriyolar genellikle kültür ortamı ile temas halinde olan kahve çekirdeklerinini altında ve ayrıca kallusun üst yüzeyinde oluşur. Öte yandan, tüm kalluslar somatik embriyo oluşturmaz. Embriyojenik hücrelerin indüksiyonu, kallus yaşamının kesin bir anında gerçekleşir. Bu indüksiyon penceresi, kullanılan yetiştirme koşullarına ve özellikle hormonal dengeye bağlı olarak aynı genotipin özdeş eksplantları için değişebilir. Aynı eksplantta, yetkin veya yetkin olmayan kallus bölümleri bulmak mümkündür, bu da genetik olarak özdeş hücrelerin belirli bir uyarana ve farklı tepki verebileceğini gösterir.
Embriyojenik hücreler, farklılaşma olayının meydana gelmesi nedeniyle bölünme yeteneklerini hızla kaybederler, bu nedenle kallusun embriyogeneze transfer anı çok önemlidir. Kahve çekirdeği yaşlandıkça, embriyojenik hücreler embriyo oluşturma konusundaki özgüllüklerini kaybeder. Somatik embriyo oluşumu sürekli bir süreçtir ve aynı kültürde aynı eksplantta aynı anda birkaç embriyonik aşama meydana gelebilir.

Kaynakça:
media.neliti.com/media/publications/63679-EN-direct-and-indirect.pdf
scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid

Yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu