Bir gende mutasyonların oluşturulduğu yöntemler, genin fonksiyonunu araştırmak için kullanılır. Bunun için mutajen olan (mutasyon yapıcı) kimyasal maddelerin kullanılması maliyetlidir ve geniş ölçekte gen fonksiyonunun araştırılmasına olanak tanımaz. Bu nedenle, mutasyon oluşturmak için genoma yerleşebilen transpozonların kullanılması daha uygun bir yaklaşımdır. Transpozonlar genoma kendini yerleştirebilir ve bir etiket olarak görev yapabilir. Bu sayede transpozonların genomdaki yeri ve gen fonksiyonuna etkisi değerlendirilebilir. Buna rağmen memelilerde taranspozon kullanımı, etkili bir transpozon sisteminin eksikliği nedeniyle sınırlıdır.
Transpozonların Mekanizması
Bir DNA segmenti, orijinal yerinden kopyalanabilir, kesilebilir ve halkasal hale geçtikten sonra DNA’da başka bir yere yerleşerek burada işlevini sürdürebilir. Bu sürece transpozisyon denir ve transpozisyon sürecinden geçen DNA parçasına da transpozon denir. Bir transpozon, fonksiyonel bir genin içerisine girebilir. Bu olay çoğunlukla mutasyona ve genin işlevinin bozulmasına neden olur.
Genomda transpozonları kodlayan genler vardır. Transpozonlar; etki mekanizmalrındaki farklılık nedeniyle retrotranspozonlar ve DNA transpozonlar olarak ikiye ayrılır. Retrotranspozonlar kendilerini RNA’ya klonlar ve RNA tekrar DNA’ya çevrilir. DNA kopyası kendini genomda yeni bir yere yerleştirir. Bu işlem bir kopyalama-yapıştırma mekanizmasıdır. DNA transpozonları ise kes-yapıştır mekanizması ile hareket ederler. Bulundukları yerden kesilip ayrılırlar ve genomda başka bir yere yerleşirler. DNA transpozonları yeni gen araştırma ve gen işlevi belirleme çalışmaları için önemlidir.
Transpozonlar, genlerin hücredeki kromozoma yerleştirilmesi ya da bir genin yapısı bozularak işlevinin anlaşılması için kullanılabilir. Transpozonların bulunduğu yerden kesilmesi transposaz adlı enzimler sayesinde olur. Bu nedenle genetik mühendisliği yöntemlerinde transpozonlar kullanılırken, transpozas enzimi de diğer bir vektör (gen aktarmada kullanılan araç) içerisinde bulunur. Bunun yanında transpozonun özelliği, transposaz enziminin dizisinin genetik mühendisliği yoluyla ayrılmasıdır. Transpozas sadece DNA transposon fragmenti varlığında görevini yapabilir. Bu sisteme ikili transpozisyon sistemi denir ve transpozisyonun güvenliğini arttırır.
PiggyBAC (PB) Transpozonun Avantajları
Memelilerde, transpozunun kullanımı etkili bir transpozisyon sisteminin yokluğu nedeniyle sınırlıydı. Memelilerde kullanılan transpozon sistemleri: 1) Zebra balıklarından izole edilmiş olan Hat-like Tol2, 2) Kurbağa ve balık genomundaki transpozonların yapılandırılmasıyla oluşturulmuş olan Tcl-like (SB) transpozonlar, 3) Timsahtan elde edilen PB’dir. Bu transpozisyon sistemleri arasında SB ve PB memeli hücrelerinde en yüksek aktiviteyi göstermişlerdir. PB; memeli, böcek, maya gibi çok sayıda organizmada etkili olmasına ek olarak, in vitro olarak da yapılandırılabilir. SB transpozonun PB transpozonundan farklı olduğu nokta genomda CAG (DNA’da sitozin, adenin, guanin nükleotitleri) izi bırakmasıdır. Bu durum SB’nin kullanımı kısıtlar. PB’nin transpozon aktivitesi SB’den yüksektir. PB’nin iz bırakmaması ve bu sayede genoma zarar vermemesi nedeniyle, PB daha çok tercih edilir.
PB elementininin uzunluğu 2.4 kb boyutundadır. PB’deki tekrarlı dizilerin arasına bir gen yerleşebilir. Ayrı bir vektörde bulunan transpozas enzimi de transpozisyonu gerçekleştirebilir. Bu sayede genom TTAA (timin-timin-adenin-adenin nükleotit sırası) segmentinin olduğu bölgeye gen yerleşebilir.
PB kesme ve yapıştırma türünde bir transpozondur. PB elementi transpozas enzimi yardımıyla donör DNA’dan kesilir ve genoma yerleşir. PB’nin ayrıldığı kısımdaki boşluk için DNA sentezi gerçekleşmez ve boşluk DNA ligaz enzimi yardımıyla kapanır.
PB’nin diğer vektörlerden farklı bazı özellikleri vardır. Virüs vektörlere kıyasla daha güvenliklidirler. Diğer transpozonlara kıyasla daha büyük DNA parçaları (9,1-14.3 kb) taşıyabilirler. Ayrıca yüksek transpozisyon kapasitesine sahip olmaları ve iz bırakmayışı onları daha pratik bir araç yapar. PB’nin avantajları; yüksek etkinlikte transpozisyon, uzun dizi taşıyabilmesi, sabit uzun süreli ekspresyon, geni tek bir kopya halinde genoma yerleştirmesi, hedef genin in vivo takip edilebilmesi ve genomda girdiği bölgenin kolayca saptanmasıdır.
PB hedef hücre genomuna entegre olabildiği ve uzun süreli gen aktivitesi sağlayabildiği için gen terapisi uygulamaları açısından uygun bir araçtır. Ayrıca, diğer viral vektör sistemlerine kıyasla avantajları vardır. Elektroporasyon ile hücreye aktarılabilirler. Buna ek olarak, herhangi bir viral vektörlerin taşıdığı viral antijenleri taşımadıkları için, bağışıklık sistemi tepkisine neden olmazlar. Bu özellikleri klinik uygulamalar için kullanılmasını kolaylaştırır ve daha düşük maliyetlidir. 14,000 baz uzunluğuna kadar DNA dizisi taşıyabilir. Böylece bu sistemin kullanılmasıyla büyük terapötik genlerin aktarılması mümkün olabilir. Viral vektörler kıyasla üretilmesi de daha kolaydır.
Transpozisyon etkinliğinin aktarılacak bölgenin büyüklüğü arttıkça düşmesine rağmen, 14,000 baz uzunluğuna kadar büyüklükte gen bölgesi taşıyabilir. Böylece, viral vektörlerin taşıyamadığı büyüklükte DNA parçalarını taşıyabilir.
Hastalıkların tedavisinde kullanılmak amacıyla hastadan alınan deri hücrelerinin uyarılmış pluripotent kök hücrelere dönüştürülmesinde de viral vektörler kullanılıyordu. Bu işlemi yapmak için, deri hücrelerine viral vektörler aracılığıyla bir gen seti aktarılıyordu ve hücre pluripotent kök hücreye dönüşüyordu .Son zamanlarda yapılan çalışmalarda bu gen setinin PB kullanılarak aktarılmasının daha etkili, yan etki içermeyen ve daha düşük maliyetli olduğu görüldü. Böylece PB, gen terapisi alanında yeni bir dönem başlattı. Önümüzdeki yıllarda PB sisteminin kullanıldığı klinik deneylerin ardından, çok sayıda hastalığın tedavisinde bu sistemin kullanıldığını görebiliriz.
Kaynakça:
1) Zhao ve ark. PiggyBac transposon vectors: the tools of the human gene encoding. Transl Lung Cancer Res 2016;5(1):120-125
2) Bigot. Mobile Genetic Elements, Protocols and Genomic Applications.
Yazar: Ayça Olcay