İmmunohistokimya tekniği, bir hücre ya da dokuda özel bir antijeni (proteini) ya da hücreyi arama tekniğidir. Teknik iki farklı aşama içerir: 1) Lam hazırlama (örneğin sabitlenmesi ve dokunun hazırlanması) ve reaksiyon ile ilgili aşamalar (antijenin geri kazanılması ve antikorlarla ilgili muameleler), 2) yorumlama ve analiz kısımlarıdır.
İmmunohistokimya yönteminde, bir doku içerisindeki aranan antijenler; antikor uygulanması ve antikorun antijene spesifik bir şekilde bağlanması sonucu tanımlanabilir. Toplamda, antijenlerin antikorlarla tanımlaması ve görüntüleme gibi çok sayıda basamağı içerir. Aynı işlemler hücreler için uygulandığında da bu teknik, immünositokimya adını alır.
Araştırma ya da patoloji laboratuvarlarında, immünohistokimyasal reaksiyonlar farklı durumlarda uygulanır. En önemli uygulamalar: 1) tümör hücrelerinin histogenetik tanısı, 2) tümörün alt tiplerinin belirlenmesi (örneğin, lenfoma gibi) 3) malignant tümörün ilk bölgesinin karakterize edilmesi, 4) bazı hastalıklarda, tedaviye yönelik belirtilerin ve prognostik faktörlerin araştırılması, 5) iyi huylu ve kötü huylu tümör ayrımının yapılması, 6) hücre tarafından salgılanan yapıların ve materyalin anlaşılmasıdır. İmmuhistokimyanın, yararlı bir tamamlayıcı tanı yöntemi olduğu vakaların %95’inde görüldü ve tedavi edici ve cerrahi yöntemlerin işleyişine düşük maliyet ve yüksek kar ile katkı sağladı.
Yöntemin uygulanışında; örneğin laboratuvara getirilişi, örneğin sabitlenmesi ve antikor uygulanması kritik aşamalardır. Uzun süre fiksasyonda (sabitleme işlemi) kalan taze örnekler antijen özelliğini yitirebilir. Yapılan bir çalışmada; göğüs kanseri doku parçasının 12 hafta depolanmasının ardından antijen özelliğini kaybettiği görülmüştür. Ancak, aynı durum 10 yıldan fazla parafine gömülmüş halde saklanan doku parçaları için geçerli değildir. Örneğin; formaldehitte sabitlenmek ve parafine gömmek, uluslarası olarak en yaygın kullanılan histoloji yöntemi olmuştur. Fakat, formaldehit kullanımı antikorların bağlanmasında hata ile sonuçlanabildiği için başka sabitleyiciler de kullanılmıştır. Bu nedenle, alkol ve aseton gibi alkol temelli olanlar da kullanılmıştır.
Tekniğin Uygulanışı
Doku işlenirken, yüksek sıcaklık koşulunda (genellikle 60 derecenin üzerinde) parafinle kaplanır. Diğer bir önemli aşama lamların hazırlanmasıdır. Örnek içeren parafinler, kalınlığı 3 ile 7 mikrometre arasında olacak şekilde dilimlenir. Silane ya da polilizin gibi bağlayıcılar ile hazırlanmış lamların üzerine yerleştirilir. 3 mikrometreden ince parçalara zayıf reaksiyon gösterir ve 7 mikrometreden daha kalın parçalar ise dokunun bir kısmının görüntülenememesine yol açabilir.
Antikorların örneğe bağlanmasının ardından mikroskopta görüntü alabilmek için, avidin-biotin peroksidaz kompleksi (ABC) ve streptavidin-biotin kompleksi (LSAB) kullanılır.
Yöntemde iki çeşit antikor kullanılır. Bunlar; primer ve sekonder antikorlardır. Primer ankikorlar ise monoklonal ve poliklonal olarak ikiye ayrılırlar. Poliklonal antikorlar bir antijende birden fazla bölgeyi tanıyabilirler ve bağışıklık kazandırılmış hayvanlardan elde edilirler. Monoklonal antikorlar ise antijende tek bir bölgeyi tanıyarak daha spesifik sonuçlar verirler.
İmmünohistokimyada güvenilir sonuçların ortaya çıkması için önemli nokta; duyarlı ve spesifik primer antikorlar kullanmaktır. Antikorun ilgili proteini tanıma yeteneği görüntünün kalitesini arttırır. Çok sayıda şirket ve akademik laboratuvarlar proteinlere özgü primer antikorlar sağlar. Uygun primer antikorun seçimi literatür araştırmasıyla ya da deneysel olarak yapılır. Ayrıca, uygun bir sekonder antikorun seçilmesi de görüntü ve analiz için önemlidir. Sekonder antikorlar primer antikorlara bağlanır ve aynı zamanda floroforlara da bağlı olurlar. Buradaki floroforlar görüntülemeyi sağlayan floresan moleküllerdir. Bu sayede sekonder antikorlar, ışıma ile görüntüyü sağlarlar ve görüntü mikroskop tarafından yakalanır. Eğer iki farklı florofordan gelen sinyal çakışırsa, hatalı bir görüntü elde edilir. Çakışmayan sekonder antikorların kullanılabilmesi için, kontroller önemlidir. Bu kontroller, tek bir primer-sekonder antikor kombinasyonuyla işaretlenmiştir.
Yanlış bir antikor bağlanmasından kaynaklı olarak sonucun hatalı olup olmadığının belirlenebilmesi için negatif kontroller ve pozitif kontroller de kullanılır ve örnekle kıyaslanır.
İmmünohistokimyanın mikroskoptaki görüntüye göre yorumlanması, genellikle kalitatif ve göreceleri bir durumdur. Özel bir molekülün hücresel yokluğu ya da varlığının yorumlanması gerektiğinde kalitatif analiz kullanılır. Fakat, patoloji laboratuvarlarında immünohistokimyanın rutin bir teknik haline gelmesinin ardından protein protein miktarı kantitatif olarak saptanmaya çalışılmıştır. Kantitatif analiz yöntemleri ise son yıllarda gelişmiştir. Bunun için, ışıma yapan hücrelerin yüzdesinin hesaplandığı ve bilgisayar temelli yöntemler kullanılır. Buna rağmen, araştırmacılar protein miktarı hesaplamak için ELISA ve western blot yöntemlerini daha yaygın olarak kullanılır. İmmünohistokimyanın ise en büyük faydası, özellikle patoloji laboratuvarlarında, tanı koyulması, kanser hücreleri ve diğer hücrelerin alt türlerinin tanımlanabilmesidir.
Kaynakça:
1) Luango de Matos ve ark. Immunohistochemistry as an Important Tool in Biomarkers Detection and Clinical Practice. Biomarker Insights 2010:5
2) Glynn ve McAllister. Immunocytochemistry and quantification of protein colocalization in cultured neurones. Nature protocol, 2006.
Yazar: Ayça Olcay