Günümüzde ilaç ve biyoteknoloji sektöründe; hücreler biyofabrikalar gibi kullanılarak, hücrelere ilgili genlerin dışarıdan aktarılmasıyla büyüme faktörleri, insan insülin hormonları ve antikorlar gibi hastalıkların tedavisi için kullanılan proteinler, geleneksel yöntemlere kıyasla daha yüksek verimde üretilebilmektedir. Örneğin bu sayede tüm dünyadaki diyabet hastaları, insan insülin geninin tütün bitkisine aktarılmasıyla, tütün bitkisinden bol miktarda üretilebilen insan insülin hormonunu kullanmaktadır. Bu yöntem geliştirilmeden önce ise diyabet hastaları, domuz pankreasından elde edilen, daha maliyetli olan ve insanlarda alerjiye sebep olan insülin hormonunu kullanıyorlardı. Son yıllarda sıkça bahsedilen genetik mühendisliği yöntemleri nasıl kullanılır ve hücrelerin bu proteinleri üretmesi nasıl sağlanır?
Protein üretimindeki sınırlayıcı aşama, istenilen proteini yüksek miktarda ve çözünebilir formda üretebilen bir yapının oluşturulmasıdır. Bu işlem için, proteini kodlayan gen plazmid isimli halkasal DNA parçasının yapısına eklenir (klonlanır) ve plazmid genin hücreye aktarılması için aracı (vektör) görevi görür. Protein üretimi için genlerin bir aracıya klonlanması bazen mümkün olsa da, özellikle insan proteinleri için fonksiyonel anlatım gösteren gen klonlarının etkili bir şekilde üretimi ciddi bir darboğazdır. Sıklıkla, proteinlerin üretilmesi zor, karmaşık ve çok basamaklı bir işlemdir. Çünkü genden proteinin üretilmesi aşamasında hata olabilir ya da protein çözünmeyen agregatlar halinde sentezlenebilir ve standart yöntemlerle saflaştırılamazlar. Çoğu durumda araştırmacılar klonlama aşamasına dönerler ve yeni bir klonlanacak gen parçası oluştururlar, yeni bir saflaştırma yöntemi kullanırlar ya da proteini farklı bir konak hücrede üretirler. Bu da genellikle yeni bir klonlama deneyinin oluşturulmasını gerektirir ve dizileme analizinin de dahil olduğu çok basamaklı bir işlemdir. Çoğu araştırmacı, bir klon oluşturur, onu dener ve eğer hata meydana gelirse başa döner ve yeniden başlar. Bu nedenle, protein üretimi oldukça maliyetli ve zaman alıcıdır.
Rekombinant DNA teknolojisinin gelişimi ile protein üretim yöntemleri değişti. Bu aşamadan sonra hücreye birden fazla gen düşük maliyetle aktarılabilir hale gelmiştir ve sistemin manipülasyonu mümkündür. Çok sayıda rekombinasyon klonlama sistemi mevcut iken, Gateway sistemi adındaki yöntem en yüksek oranda esnekliği gösterir. Bu sistem, protein üretimi için hızlı ve dayanıklıdır.
Gateway sistemi, çok çeşitli konak hücre için kullanılabilecek bir protein üretim yöntemidir. Bu sistemin avantajı, sadece tek bir gen yerine eş zamanlı olarak birden fazla genden protein üretilmesinin sağlanmasıdır. Bu da yöntemin başarı şansını arttırır. Ayrıca bu yöntemde, deneysel çalışmaların yanı sıra endüstriyel ölçek için de büyük miktarlarda protein üretmek mümkün olur.
Gateway sistemi; çok aşamalı bir klonlama yöntemidir ve vektörler arasında genler transfer edilirken klasik restriksiyon enzim (DNA’yı kesen bir enzim) kesimi ve ligaz enzimlerine (DNA parçalarını birbirine bağlayan bir enzim türü) gerek duyulmaz. Bu yöntemle klonlamanın avantajlarından biri de, genlerin birden fazla vektöre rekombinasyon (iki DNA parçasının parça alış verişi yapması) yoluyla geçmesidir. İki tür klon Gateway yönteminde kullanılır. Bunlardan biri; Entry klonlardır ve transkripsiyonel olarak sessiz olup dizisi bilinmektedir. Ekspresyon klonu ise proteinin üretileceği yapıdır ve Entry klon ile rekombinasyon yapar. Rekombinasyon, vektörle üzerinde bulunan att bölgeleri arasında gerçekleşir. Bu bölgelerin dört türü vardır. Bunlar; attP, attB, attL, ve attR’dir. Entry klonlar attL bölgelerini içerirken, ekspresyon klonlar attB bölgelerini içerir.
İstenilen proteini üretecek olan gen, çeşitli yollarla Entry klon isimli aracıya aktarılabilir. Klonlama stratejisindeki esnekliği arttırabilmek için, Gateway rekombinasyon reaksiyonu genlerin Entry klona transferi için kullanılabilir. Entry klon oluşturulup, dizisi onaylandığında, ikinci bir rekombinasyon reaksiyonu, ilgili geni Entry klonundan final ekspresyon klonuna aktarmak için kullanılır. Bu transferde kullanılan vektöre ise Destination vektör denir. Destination vektör proteinin üretilmesi için gerekli bütün DNA dizilerini taşır. Bu diziler; promotör (genden proteinin üretilmesi için enzimin bağlandığı dizi), antibiyotiğe direnç geni ve plazmid replikasyon orjinleridir. İlgilenilen genin olduğu kısım Gateway kaseti içerir. Bu bölgede kloramfenikol direnç geni ve ccdB isimli toksin bulunur. Bu genlerin yanında attR rekombinasyon bölgeleri vardır. Tüm kaset rekombinasyon reaksiyonuyla transfer edilir. Bu reaksiyonundan sonra final ekspresyon klonu (genin proteini üreteceği vektör), Destination vektörün tamamını içerir ve Entry klonuna yerleştirilmiş olan Gateway kaseti içerir. Destination vektördeki antibiyotiğe direnç genleri, işlem sırasında hücre popülasyonundan genin aktarılamadığı hücrelerin antibiyotik varlığında elenmesini sağlar. Böylece, sadece genin aktarıldığı bir hücre topluluğu elde edilir. Bu da ekspresyon klonunun yüksek etkinlikte üretilmesini sağlar.
Genetik mühendisliği yöntemlerinin gelişmesiyle birlikte gelecekte, sağlıkta ya da başka alanlarda gerekli olan tüm proteinlerin daha ucuz ve fazla miktarda üretilmesi mümkün olabilir.
Kaynakça:
A. Doyle. High-Throughput Protein Expression and Purification
Yazar: Ayça Olcay