Gen Terapisinde Kullanılan Yöntemler

Neredeyse 50 yıl önce bilim insanları, hücreye dışarıdan verilen bir DNA molekülüyle yapılacak genetik değişikliğin, kalıtsal insan hastalıkları için etkili bir tedavi olabileceğini düşündüler. Gen terapisinin klinik uygulamaları uzun ve dolambaçlı olsa da, gen terapisi tıptaki birçok alana yeni tedavi seçenekleri sunuyor.

Retrovirüsler ve adeno ilişkili virüsler (AAV) gibi gen terapisi vektörlerinin (genin hücrelere aktarılması için araç olarak kullanılan genetik materyal) geliştirilmesiyle, klinik öncesi hastalık modellerinde cesaret verici sonuçlar elde edildi. Bunun sonucunda, 1990’lı yılların başında, gen terapisinin klinik denemeleri başladı. Maalesef bu erken klinik denemelerde; vektörlere karşı bağışıklık sistemi tepkisi ve proto-onkogenlerin (mutasyona uğradığında tümör oluşumuna neden olan genler) vektörlerle aktifleşmesi sonucu meydana gelen tümör oluşumu dahil, terapiyle ilişkili ciddi toksik etkiler ortaya çıktı. Bu aksilikler; viroloji, immünoloji, hücre biyolojisi ve model geliştirme alanlarındaki daha temel araştırmaları teşvik etti ve en sonunda yapılan temel araştırmalar, 2000’li yıllarda klinikte gen terapisinin başarılı olmasını sağladı. Lentiviral vektörler, çoğalmayan hücrelere gen aktarılmasının verimini arttırmada kullanıldı. Erken faz klinik denemelerde daha etkili ve güvenli vektörler, otolog (hastanın kendisinden alınan) kan hücrelerine transfer için kullanıldı. Buradaki amaç, bağışıklık sistemi yetersizliği, hemoglinopati ve metabolik hastalıkları olan hastalara fayda sağlamaktır. T hücrelerine, C19 reseptörüne bağlanabilen kimerik antijen reseptörleri sentezlemesi için müdahale edildi ve bu T hücrelerinin lenf kanserinde ati-tümör aktivite gösterdiği tespit edildi. Doğuştan körlük, hemofili B ve spinal kas atrofisi hastalıklarında; retina, karaciğer ve sinir sistemine AAV vektörlerinin aktarımı sonucu klinik ilerlemeler gözlendi. 2017’de FDA tarafından ilk gen terapi ürünü onaylandı. Onaylanan bu gen terapisinde kimerik antijen reseptörü içeren T hücreleri kanserleşmiş B hücrelerine saldırıyor (FDA onaylı gen terapileriyle ilgili daha ayrıntılı bilgi için: https://www.bilgiustam.com/fda-tarafindan-onaylanmis-gen-terapisi-yontemleri/). Ayrıca, nöral hastalıklar ve hemofili için umut verici klinik denemeler de gelecekte yeni gen terapisi yöntemlerinin onaylanmasıyla sonuçlanabilir.

Son yıllarda, genom editleme teknolojisi bakteriyal nükleaz (DNA’yı kesebilen enzimler) enzimlerine bağlı olarak gelişti. Sadece gen eklenmesine aracılık edebilen viral vektörlere kıyasla genom editleme yaklaşımı; geni ekleme, geni çıkarma ve geni düzeltme olanaklarını sunar. Bu yöntemin hastaların tedavisi için uygulanma düşüncesi henüz yenidir ve çok sayıda klinik denemenin gelecekte yapılması bekleniyor.

Retroviral Vektörler

Genom paketleme sinyalinin tanımlanması retroviral vektörlerin geliştirilmesini sağladı. 1990’ların başında gama-retrovirüsler kan hücrelerine gen aktarımı için geliştirildi. C-tipi retrovirüsler ise, T lenfosit hücrelerine gen aktarımı için geliştirildi.

Diğer tür retrovirüsler ise; spumavirüsler ve lentivirüslerdir. Gama-retrovirüs vektörlerinden farklı olarak; lentiviral vektörler bölünmeyen hücrelere gen aktarabilir. Ayrıca lentiviral vektörler daha büyük ve karmaşık gen bölgelerini aktarabilirler. Lentivirüs ve spuma virüslerin diğer bir avantajı, genlerin kodlama yapan bölgelerine girebilmeleridir. Gamaretrovirüsler ise protein kodlaması yapmayan gen bölgesine girerler ve bu da kan hücrelerinde kanserleşme riskini arttırır. Günümüzde çoğu kan hücresine aktarım uygulamalarında lentivirüsler kullanılır. Fakat, gama-retroviral vektörler de, T hücresi mühendisliği ve kan hücrelerine gen aktarımında kullanılır. Lentivirüslerin ve gama-retroviral vektörlerin yapısındaki kontrolsüz çoğalmayı sağlayan gen bölgelerinin kaldırılması tedavi riskini azaltır.

Adeno-ilişkili Viral Vektörler (AAV)

AAV vektörü hücrede serbest olarak çoğalamayacak şekilde değiştirilerek kullanılır. AAV’deki tüm viral diziler, kodlanmak istenen genin dizisiyle değiştirilir. AAV vektörüyle ilgili bir sınırlama; 5000 nükleotitten büyük DNA’yı paketleyememesidir. AAV vektörleri genoma entegre olmaz ve transfer edilen DNA hücrede serbest olarak sabit kalır. Böylece genoma eklenmeden kaynaklı riskler görülmeyebilir ama bu vektörün uzun süreli aktivitesi de sınırlı olur.

1990’ların ortasında iki araştırma grubu, farede kasa AAV vektörünün aktarıldığında uzun süreli aktivite olduğunu gösterdiler. Buna ek olarak bu vektörün; karaciğer, retina, kalp kası ve merkezi sinir sistemine aktarılabildiği gözlemlendi. 1990’lı yılların sonunda AAV’de hemofili B için klinik denemeler yapıldı ve kasa AAV enjekte edildi. Bu erken denemeler güvenliydi ama doz yetersizliği nedeniyle sınırlıydı.

Genom Editleme

Viral vektörlerin aksine bu yöntem gen düzeltme ve gen çıkarma işlemlerini de yapabilir. Genom editleme hücreler üzerinde ve doğrudan organlara yapılabilir. Hedeflenmiş DNA değişimi, DNA’nın iki zincirinin de kırılmasıyla başlar ve zincir kırıkları parça değişimini uyarır. Kırılan bölgenin homolog olmayan onarımla onarılması gen aktivitesini baskılar. Çünkü bu onarım çeşidi hataya eğilimlidir. Homoloji bağımlı onarım, bir kalıp DNA’yı referans alarak bölgeyi nükleotitlerle doldurur.

İlk genom editleme çalışmaları, çinko parmak nükleazlara (ZFN) ya da meganükleazlara dayanır. Bu nükleazlar da DNA’da çif iplik kırığı oluştururlar. DNA’da hedef bölgenin tanımlanabilmesi için çok sayıda proteine gereksinim duyarlar ve bu durum kullanımlarını kısıtlar. 2009 yılında bakterilerden izole edilen TALE proteinleri ve TALEN nükleazları kullanıldı. Bu enzim DNA’yı kesebilir ama her bir DNA çifti için yeni bir nükleaz çiftine gereksinim duyulur.

2012 yılında Doudna ve Charpentier tarafından, bakteri savunma sisteminde bulunan CRISPR-Cas9 nükleazının keşfiyle genom editleme teknolojisi için yeni bir yaklaşım ortaya çıktı. Bu sistemde, hedeflenecek diziye özel olarak tasarlanan RNA ile Cas9 nükleazı ile genomda istenilen yer kesilebilir. Ayrıca, CRISPR-Cas9 bileşenleri hücreye viral vektöre ihtiyaç duyulmadan RNA-protein kompleksi olarak aktarılabilir.

CRISPR-Cas9 yöntemine dayanan uygulamalar klinik olarak henüz çok yenidir. Uygulama sırasında, uygulanabilirlik ve güvenlik açısından aksilikler olabilir. Bu nedenle, klinik denemelerin dikkatlice tasarlanması gerekiyor. Örneğin; nükleazların DNA’da hedeflenen yerden başka bir yeri kesebilir ve bu da beklenmedik sonuçların ortaya çıkmasına neden olabilir. Ayrıca, nükleazların verilen canlıda bağışıklık sistemi tepkisi oluşturma olasılığı vardır.

2015 yılında Çin’de yapılan bir çalışmada insan embriyoları üzerinde hemoglobin geni için yapılan gen editleme çalışmasında nükleaz, istenmeyen bölgeleri de kesmiştir. Bu nedenle, gen editleme konusunda, klinik çalışmalara geçilmeden önce klinik öncesi çalışmalarda uygun bir nükleaz sistemi tasarlanması gerekiyor. Mevcut sorunlar aşıldığında gelecekte, şu an kullanılan kimyasal ilaçlar gibi hastaların rutin olarak gen terapisi aldığını görebiliriz.

Kaynakça:
Dunbar ve ark. Gene therapy comes of age. Science 359, 175 (2018)

Yazar: Ayça Olcay