Rekombinant DNA teknolojisindeki en önemli gelişmelerden birisi de anlamı bir gendeki baz dizisinin düzenini çözmek olan DNA sekansıdır. Baz dizisi çözülmek istenen genin yeterince kopyasını yapabilmek için sözkonusu geni içeren kromozomun bir segmenti bir plazmit içerisine verilir ve böylece defalarca kendini eşlemesi sağlanır. Diziyi çözmek için kullanılan en önemli yöntem bu kromozom segmentinin kopyalarını bir endonükleaz ekleyerek ölçülebilir uzunluktaki parçalara ayırmakla başlar. Bu enzimin özgüllüğü nedeniyle kromozom segmentinin her bir kopyası özdeş parçalara ayrılır. Bu parçalar daha sonra özelliklerine göre (bu genellikle moleküler ağırlıktır) kısımlara ayrılır ve her özdeş fragman iki iplikçiği birbirinden ayırmak için denatüre edilir. Karmaşık bir moleküler hile yapılarak her iplikçiğin bütün kopyaları izole edilir ve radyoaktif bir markır kullanılarak bir ucundan işaretlenir. Bu fraksiyon daha sonra dört eşit parçaya bölünür ve DNA’yı spesifik bir bazın yakınından kesen düşük konsantrasyonda bir enzim ile muamele edilir; bu enzimlerin bazıları sitozin için diğerleri de örneğin guanin için özelleşmiş kimyasallardır.
Sonuçta her bir spesifik bazın yakınından kesilen DNA, uzunluğu boyunca farklı bölgelerden ayrılır. Bazen şans eseri olarak iki üç kez kesilebilir ancak her kırılma noktası kesici enzimin spesifik olduğu baz tipine komşudur. Sonuç değişik uzunluklarda işaretlenmiş fragmanlardan oluşturulmuş bir yığındır; ve yığındaki her işaretli fragman daha ziyade ağırlığına (uzunluğuna) göre ayrılır. Bu fragmanların ağırlığı bir jel üzerinde radyoaktif bir bant ortaya çıkartır ve böylece her bant bazın bir kopyasının pozisyonunu (işaretlenmiş olan uçtan uzaklığını ) belirlemiş olur. Diğer üç kısımdaki fragmanlar üç bazın yeri hakkında bilgi verecektir. Her bir örnekten elde edilen bantlar oluşunca bazların sekansı rahatlıkla okunabilir hale gelir.
Kromozom parçalarının tüm baz dizisini okuyabilmek için her bir örnekte aynı işlem tekrar edilmelidir. Bu noktada sekansları birbirine uyacak şekilde uygun bir düzende sıraya koymak için henüz geçerli bir yöntem geliştirilemediğini söylemek gerekir. Bu aynı kromozomun fragmanlarının başka bir diziliminin farklı bir endonükleaz ile muamele edilmesi sonucu sağlanabilir ve sonra bu fragmanlar sekanslanır. İkinci endonükleaz DNA’yı farklı bir noktadan keseceği için birinci analiz sonucu ortaya çı kan segmentlerin kırılma noktası ikinciden gelenler ile çakıştırılır. Böylece birinci ve ikinci analiz sonucu çakıştırılan dizilerin başlangıç ve sonlarına bakılarak fragmanların tam sekansı ortaya konabilir.
Kaynakça:
Khan Academy
Yazar: Taner Tunç