DNA; adenin, guanin, sitozin ve timin olmak üzere dört tane farklı nükleotitten oluşur. Bu nükleotitlerin farklı kombinasyonlarla sıralanmasıyla da DNA dizisi oluşur. DNA üzerinde bulunan genler de birbirlerinden farklı dizilere sahiptir ve buna bağlı olarak farklı işlevler gösterirler. Canlıların genomunun dizisini (genlerle ve DNA’daki diğer dizilerle birlikte) bilmek ise, hem canlıların doğasını hem de genetik hastalıkların mekanizmasını anlamak açısından oldukça önemlidir.
DNA’nın çok uzun bir molekül olduğunu düşünecek olursak, DNA dizilemenin yapılması çok zor ve ileri düzey teknoloji gerektiren bir işlemdir. Bu nedenle teknolojik gelişmelerle birlikte gelişmesi yıllar almıştır.
DNA dizileme ile ilgili yapılan ilk çalışmalardan birini Fred Sanger yapmıştır. Fred Sanger kendi bilimsel bilimsel yaşamını dizilerin belirlenmesine adamıştır. DNA’dan önce, bazı protein ve RNA molekülleri dizilenmiştir.
İlk dizilenmiş protein insülindir. 1950’li yıllarda Sanger tarafından dizisi ortaya çıkarılmıştır. İnsülinin dizisini belirlerken ilk aşamada, insülinin iki zincirini parçalara ayırmıştır. Bu parçaların dizisini çıkarmıştır ve dizisini çıkardığı parçaları kıyaslayarak parçaların örtüştüğü yerleri bulmuştur. Çalışmasının sonucunda su götürmez bir şekilde, proteinlerin amino asitlerden oluştuğunu kanıtlamıştır. Edman degredasyonuna (peptit zincirinin azot ucundan tekrarlanan eleme) kıyasla protein dizilemesini daha kolay hale getirmiştir. Bu yöntemler oldukça külfetli olmasına rağmen, çok sayıda protein 1960’lı yılların sonuna doğru dizilenmiştir ve türler ve bireyler arasında protein dizilerinin çeşitlilik gösterdiği görülmüştür.
1960’lı yılların başında RNA dizilime de benzer yöntemle yapılmıştır. RNAase enzimleri aracılığıyla RNA parçalara bölünmüştür. Parçalar, kromatografi ve elektroforez yöntemleriyle ayrılmıştır. Her bir parçaya eksonüklaz (molekülü iç kısımlarından kesen bir enzim) uygulanmıştır ve parçaların örtüştüğü noktalar bulunarak dizi açığa çıkarılmıştır. İlk ortaya çıkarılan RNA dizisi alanin amino asidinin taşıyıcı RNA’sıdır. Bunun için 5 kişi 3 yıl boyunca 1 gr saf materyal (140 kilo mayadan izole edilmiş) üzerinde çalışmıştır. Bu şekilde 76 nükleotit tanımlanmıştır. Bu süreç parmak izi tekniğiyle basitleştirilmiştir. Bu teknikte radyoaktif şekilde işaretlenmiş RNA parçaları ayrılır ve iki boyutlu olarak görüntülenir. Böylece boyutu ve dizisi tanımlanır.
DNA Dizilemenin Keşfi
DNA dizilemeye dair ilk girişimler zahmetliydi. 1968 yılında, Wu isimli bir araştırıcı primer (kısa DNA dizileri) uzatma yöntemini, lambda bakteriyofajının (bakterileri enfekte eden virüs türleri) DNA’sının ucundaki 12 bazı tanımlamışlardır. 1973 yılında, Gilbert ve Maxam DNA’da laktoz baskılayıcı bağlanma bölgesini tanımladılar. Bunu yaparken, dizi RNA’ya çevrilmiş ve parçalar dizilenmiştir. Bu işlem iki ay aldı. Bir bazı tanımlamak ise bir ay sürdü.
1976 yılı civarındaki gelişmeler sonucunda, iki yöntem yüzlerce bazı bir akşamda diziledi. Bu iki yöntem: Sanger ve Coulson tarafından geliştirilen zincir üretim yöntemi ve Maxam ve Gilbert tarafından geliştirilen kimyasal parçalama yöntemidir. Sanger’in yönteminde kalıp DNA’dan dideoksi grubu eklenmiş nükleotitler ve diğer nükleootitlerin karışımı ile sentez yapılır.
Dideoksinükleotidin eklendiği noktoda sentez sonlanır. Bu sayede farklı uzunlukluklarda parçalar elde edilir. Her bir parçanın sonunda, farklı bir dideoksi nükleotit vardır. Buna göre elektroforezde parçalar ayrıldıktan sonra dizi elde edilir. Maxam ve Gilbert yönteminde, Sanger yönteminden farklı olarak DNA sentezi yerine DNA’nın kesilmesine dayanır. DNA içerisindeki bazlar radyoaktif fosfatlarla işaretlenir ve radyoaktif fosfatların olduğu kısımlardan DNA parçalara ayrılır. Her iki yöntemde de fragmentler jel elektroforeziyle ayrılır. Jellerdeki her bir sütun bir baza karşılık gelir. Jel, X-ray filme koyulur. Filmdeki ışımalara göre dizi çıkarılır.
Bu yöntemler shotgun dizilemenin geliştirilmesiyle hızlandırılmıştır. Shotgun dizileme, rastgele DNA parçalarının dizilenmesine ve ardından parçalarda örtüşen kısımlara göre dizinin çıkarılmasına dayanır. Bu yöntem, 1979 yılında Staden tarafından önerilmiştir. Tek zincirli M13 klonlama fajlarının geliştirilmesiyle DNA parçaları hücre dışında birleştirildi. 1987’de otomatik floresan türevli Sanger dizileme makineleri Smith, Hood ve Applied Biosystem tarafından geliştirildi. Bu makineler, günde 1000 baz civarında dizileme yapabilmektedir. Dizilenen genom sayısı arttıkça, dataların depolanabileceği veritabanlarının (GenBank, BLAST) geliştirilmesi gerekli oldu. 1982’ye kadar yarım milyonun üzerinde baz GenBank’ta depolanmıştır. 1986’ya gelindiğinde ise bu sayı 10 milyona ulaşmıştır.
İnsan Genomunun Dizilenmesi
Shotgun stratejisi İnsan Genom Projesi’nde kullanılmıştır. İnsan genomundan elde edilen büyük parçalar, bakteriyal yapay kromozomlara (BAC) aktarılarak çoğaltılmıştır (klonlama). Her bir BAC’ta bulunan DNA parçalanmış, boyutu seçilmiş ve tekrar klonlanmıştır. Yapay kromozomların aktarıldığı hücreler çoğaltılmış ve DNA izole edilmiştir. Saflaştırılmış DNA otomatik Sanger dizilemesi için kalıp olarak kullanılmıştır. Dizileme sırasında nükleotitlerde bulunan bazlar sinyal verir ve sinyaller jelin laserle taranmasıyla elde edilir. Bu işlem bağımsız pek çok aşama içerir. Yöntemin başarısı için bu aşamaların hepsinin etkili olması önemlidir.
Daha büyük genomlerın dizilenmesine dair çalışmalar yapıldıkça, her aşamanın etkinliği artmıştır. Bu durum 1990 yıllarda yapılan girişimlerle mümkün olmuştur. Bu yıllarda meydana gelen kayda değer gelişmeler: 1) Boya ile işaretli kısa diziler yerine boya ile işaretli terminatörlerin (DNA dizilerinin uç kısımları) kullanılması ile bir yerine dört tane dizileme reaksiyonu eş zamanlı gerçekleşebiliyordu. 2) Doğrusal amplifikasyon (DNA’nın çoğaltılması) reaksiyonları kalıp DNA ihtiyacını azalttı. 3) Manyetik boncuk temelli DNA saflaştırma reaksiyonları, dizileme öncesindeki adımları basitçe otomatikleştirdi. 4) Kapiler elektroforezin geliştirilmesiyle jel dökme ve yükleme işlemlerine ihtiyaç kalmadı, bu da nükleotitlerden alınan floresan sinyalinin ekstraksiyonunu ve yorumlanmasını kolaylaştırdı. 5) Endüstriyel süreçler, maksimum etkinliğe ve minimum hataya odaklandı (örneğin, otomasyon, kalite kontrol, standart operasyon prosedürleri ve benzeri).
DNA dizisinin çıkarılmasından önceki aşamalar zorluğun yarısını oluşturur. Azımsanmayacak derecede fazla çaba; klonların takip edilmesi, yorumlama ve dizileme verilerin birleştirilmesi için geliştirilen yazılımlara odaklanmıştır. DNA dizisinin çıkartılması, özellikle dizi çok uzun olduğunda, bir insanın kendi başına çıkartması için zahmetli ve zaman alıcıdır. Bu nedenle teknolojinin gelişmesiyle, bilgisayarlar devreye girmiştir. Örneğin; dizi okumalarının manuel olarak düzenlenmesinin yerini, phred (bazdan gelen sinyalin kalitesini ölçen ve birbirine yakın tekrarlı dizilerden ayırmaya çalışan yöntem) gibi yöntemler almıştır. Her bir okuma üst üste binmeler (parçalarda ortak olan kısımlar) şeklinde birleştirilir ve uzun bir dizi elde edilir. Daha karmaşık olan genomlarda tekrarlanan dizilerin çokluğu işlemi daha şaşırtıcı hale getirir. Bir BAC’ın shotgun dizilemesinde bile, bazı diziler gösterilememiştir..
Süreç anahatlarıyla oturmuş görünse de, dizileme teknolojilerindeki asıl büyük ilerleme, 1990’lı yılllarda bilgisayar bilimlerinin gelişmesiyle mümkün olmuştur. 2001 yılına kadar az sayıda akademik genom merkezi, otomatik üretimle günde 10 milyon kadar baz üretebiliyordu. Genom birleştirme yazılımları (phrap, TIGR assembler ve Celera assembler) hem insan genom projesinin içerisinde hem de proje dışında olgunlaştı. İnsan genom projesi kapsamında dizilenen insan genomu, C. elegans’tan 30 kat daha büyüktür ve daha fazla tekrarlı dizi içermektedir. Bu dizi 2004 yılında tamamlanmıştır. 2004’e kadar dizileme cihazları 600-700 baz çiftine karşılık 1 amerikan doları olacak şekilde seri üretim yapıyordu.
1980’li ve 1990’lı yıllarda araştırmacılar, elektroforeze dayalı dizilemeye alternatif aramışlardır. Bu çabaların İnsan Genom Projesi’nin bitişine kadar sonuç vermemesine rağmen, yeni nesil DNA dizileme (NGS) yöntemi Sanger dizilemenin neredeyse yerine geçti. NGS teknolojileri, Sanger dizilemeden birkaç yolla keskin şekilde ayrılır. Fakat anahtar nokta NGS’nin çoklu bir yöntem olmasıdır. Bir tüp başına bir reaksiyon yerine, DNA kalıbının tüm parçaları, yoğun bir şekilde iki boyutlu bir yüzeye sabitlenir. Bakteriyal klonlama yerine, in vitro amplifikasyon ile dizilenecek her bir kalıp çoğaltılır. Bu sayede DNA’nın farklı parçaları eş zamanlı olarak çoğaltılarak dizilenir.
2005’te 454 ilk ticari NGS cihazı olarak ortaya çıktı. İnsan Genom Projesinde uygulanan dizileme yöntemleri birkaç genom merkezinin kaynağını oluşturuyordu. Bunu 454 ve diğer rakip cihazlar izledi. Böylece özel laboratuvarlar da genom dizileyebilecek alt yapıya kavuştu.
İnsan Genom Projesi sırasında; Roche, Illumina, Applied Biosystems, Helicos, Complete Genomics ve Ion Torrent firmaları arasında NGS konusunda yoğun bir rekabet oluşmuştur. Bu rekabet sonucunda, 2007-2012 yılları arasında herbir baz başına DNA dizileme fiyatında hızlı bir düşüş oldu.
2012’den itibaren ilerlemenin temposu ve firmalar arasındaki yarış zayıfladı. 454, SOLiD ve Helicos platformları artık gelişme göstermemektedir. Bunun yerine Illumina platformu baskın hale gelmiştir. Buna rağmen, 2005 yılından günümüze kadar NGS teknolojisinde önemli gelişmeler yaşanmıştır. NGS teknolojisi ile %99.9’un üzerinde doğrulukla okuma DNA dizisi çıkartılabilir. Gelinen son noktada, 1 milyar DNA bazı okuması bir cihaz ile (Illumina NovaSeq) iki gün içerisinde yapılabilir ve maliyati birkaç bin dolar tutar. Dizileme teknolojisi gelişmesine rağmen, bu alanda yapılan çalışmalar devam etmektedir. Bu aşamadan sonra üzerinde çalışılan konular; tek molekül dizileme ve DNA üzerindeki metillenme gibi modifikasyonların haritasının çıkarılmasıdır.
Kaynakça:
1) Shendure ve ark. DNA sequencing at 40: past, present/
and future. doi:10.1038/nature24286.
Yazar: Ayça Olcay