Herhangi bir malzemenin şekil ve morfolojisinin özellikleri üzerindeki temel etkisini incelemek için, morfolojisini bilmek ve incelemek çok önemlidir. Odaklanmış iyon ışını (FIB) tomografisi, 3 boyutlu bir kimyasal ve yapısal ilişki çalışma tekniğidir. FIB’nin enstrümantasyonu, taramalı elektron mikroskobuna (SEM) benzer, ancak tarama için kullanılan ışında büyük bir farkı vardır.
SEM için, tarama ortamı ile bir elektron demeti kullanılırken, FIB’de tarama için çok odaklanmış bir iyon demeti kullanılırken FIB, litografi ve ablasyon amaçları için kullanılabilir. Ancak gelişmeler ve yüksek enerjili odaklanmış ışın nedeniyle, günümüzde bir tomografik teknik olarak kullanılmaktadır. Tomografi, istenen herhangi bir alanı sektörlere ayırarak veya enine keserek görüntüleme olarak tanımlanır. FIB’nin enerji dağılımlı spektrometri veya ikincil iyon kütle spektrometresi ile hecelenmesi, bir numune için çok yüksek çözünürlüklü 3D görüntülerle temel analiz verebilir. Bu teknik, kalitatif ve kantitatif analizlerin, 3B hacim yaratımlarının ve görüntü işlemenin tanınmasına katkıda bulunur.
Malzeme Karakterizasyonu
Malzemeler
FIB / SEM, mikrodan nanometre ölçeğine kadar değişen malzemeleri karakterize etmek için en yeni araçlardan biridir. Çift ışınlı kurulum nedeniyle, FIB / SEM, tarama amacıyla numuneyi dilimlemek için iyon demeti ve SEM’i kullanan en modern kurulumlardan biridir. Aynısı FIB-TEM ve FIB-EDS karakterizasyon teknikleri için de geçerlidir, burada FIB bir dilimleme ve öğütme kaynağı iken, TEM veya EDS ilgili karakterizasyon için bir araçtır.
Örnek hazırlama
FIB-SEM ve FIB-EDS’den kompozit malzeme Al-Si’nin çok sayıda elementel güçlendirilmiş alaşımları çalıştırılmıştır. Bu örneklerin morfolojik düzenlemesi, kompozitte bulunan Si içeriğinin yüzdesine, takviye konsantrasyonuna ve ayrıca kalıplama prosedürüne bağlıyken takviyeler arasında Ni, Fe ve Mg bulunur. Tüm malzemeler SiC kağıt yardımı ile 300 rpm dönüş hızında, SiC boyutları ise 320, 500, 1000 ve 2400 öğütülmüştür. Ayrıca numune yüzeyleri 1, 3 ve 6 m partikül büyüklüğünde DP-elmas pasta ile işlenmiştir. Mümkün olduğunca parlak ve pürüzsüz bir yüzey elde etmek için 150 rpm döndürücü hızında ve son rötuşlar MgO kullanılarak yapılmıştır. Bu amaçla nikel malzeme sinterlemeyi takiben üretilmiştir.
Metodoloji
FEI strata DB235 Dual Beam Workstation, öğütme için Galyum iyon kaynağını (İyon Işını) ve tarama amacıyla elektron demetini (SEM) kullanan numuneyi analiz etmek için IB ve EB arasında ayarlanan açı 0 ile 52 kullanılmıştır. Numunenin ilgi alanı, SEM kullanılarak seçilmiş ve öncü gazın FIB ile indüklenen ayrışmasının dahil edilmesiyle koruyucu Pt tabakası ile kaplanmıştır. Bu koruyucu katman, frezeleme sırasında daha iyi kesimler elde etmeye yardımcı olur. Hendek (öğütme işlemi ile), numunenin taranması sırasında hendek üzerinde numune kenarlarının gölgesi olmayacak şekilde numuneye kazılmıştır.
Alt görüntü A, XY ekseninde hücre üzerindeki hendek gölgesini gösterirken, alt görüntü B düzeltilmiş versiyonunu gösterir. Kenar alanında frezeleme yapmak daha iyidir, ancak yalnızca dengeli kompozisyon ve yapıya sahip numuneler için mümkündür. Diğer numuneler için numuneden ilgi alanının belirlenmesi ve mikromanipülatör yardımı ile kenara getirilmesi önerilmektedir. Oysa püskürtülen örneğin birikmesini önlemek için ilgi alanı çevresinde iki ek hendek kazılabilir. Frezeleme işlemi, 20 nA düzeyinde mevcut kiriş kullanılarak yapılır. Öğütme kriterleri, mümkün olan en küçük parçacığın net bir 3B yüzeyini elde etmek için gereken kesit sayısının frezelenmesine bağlıdır.
Alan, numuneyi analiz etmeden önce yüzeyleri cilalamak için pA aralığındaki düşük akımların etkisiyle parlatılmalıdır. Cilalandıktan sonra, numuneler, ihtiyaç duyulan en iyi morfolojik yapıları elde etmek için çeşitli çözünürlük aralıklarında SEM kullanılarak analiz edilmelidir. Örneğin, AlSi12 numunesi 300 nm’lik artışlar kullanılarak analiz edilmiş ve AlSi7Sr için kullanılan SEM artışları 83 nm olmuştur.
Uygulamalar
Sıkıştırılmış döküm AlSi7Sr’nin FIB / SEM tomografisi
Örnekler, Sr ile güçlendirilmiş ve 5 keV’de SEM yardımıyla çalışılan AlSi7 alaşım örneğini göstermektedir. Bu yöntem, öğütme yönünde 15 μm numune elde eden 60 nm’lik kesişen mesafe ile yaklaşık 250 tarama görüntüsünün üretilmesine yardımcı olur. Numunedeki Si, 200-500 nm çapında ~ 3–5 μm uzunluğunda lifler ve dallar göstermiştir. Bu lifler birbirine karıştırılır ve renk farkı ile temsil edilir. Bağlantı bağlantı boyutları 50-100 nm olan 2. yeniden yapılandırılmış bölgedeki koral yapıda Si’nin son olarak hesaplanan hacim fraksiyonu ~% 5’tir.
Gözenekli Ni’nin FIB / SEM tomografisi
SEM yüksek voksel çözünürlüğü, gözenekli nikelin 3B yapısının mimarisine yardımcı olmuştur. 3D görüntüleme, seçilen alanın yaklaşık % 2/3’lük hacminin tamamen birbirine bağlı yapı ile gözenekli olduğunu ortaya koymuştur. Kanalın iç kalibresi 500 ile 2000 nm arasında değişmektedir.
Sıkıştırılmış döküm AlSi12’nin FIB / EDS tomografisi
FIB, ikincil elektronları üreten numuneyle etkileşimin bir sonucu olan iyon demetini çalışma kaynağı olarak kullanır. Ancak enerji dağıtıcı spektrometre ile donatıldığında, bu, öğütülmüş her dilimin temel bileşiminin belirlenmesine yardımcı olabilir. EDS’nin FIB ile kullanılması, her bir dilimin temel verileriyle AlSi12 numunesinin temel bileşiminin bulunmasıyla sonuçlanmıştır. Karmaşık kimyasal yapılarla uğraşırken, bu yeni tireleme tekniğinin her dilimlemede veri üretmeye ve ilgilenilen bileşiğin tam kimyasını vermeye layık olduğu kanıtlanmıştır. Örnek söz konusu olduğunda, EDS, her bir dilimi EDX (EDS) detektörü ile analiz etmek için 8-keV hızlandırma kullanılmasıdır.
Biyolojik numune karakterizasyonu
FIB-SEM, biyolojik örneklerin analizi için kullanılacak en gelişmiş teknik olduğundan, biyolojik numuneler her zaman ısıya, neme ve basınca duyarlı olduğundan bunu yapmak için çeşitli koruyucu önlemlerin alınması gerekir. Bu nedenle biyolojik numuneler sabitlenmeli, boyanmalı ve reçineye gömülmelidir. Biyolojik numuneler büyük olduğundan, yani mikro ölçekli olduğundan, işlenmeleri için çok zamana ihtiyaçları vardır.
Görüntü işleme süresi, FIB-SEM’den geçen biyolojik örnek sırasında en büyük sınırlayıcı faktördür. Çünkü makinenin tam bir 3D görüntüyü yeniden oluşturmak için her bloğu tek tek taraması gerekir. Bu nedenle, örnek tarama süresi ile iyi çözünürlük ve uygun kontrast arasında bir denge olmalıdır. Zaman faktörünü azaltmak, çözünürlük ve kontrastı artırmak için kimyasal fiksasyon, yüksek basınçlı dondurma gibi yeni yöntemler, Si nanotellerinin 3 T3 hücre hattı ile etkileşimini göstermektedir.
Kimyasal fiksasyon işlemi
Kimyasal fiksasyon protokolleri, tiyokarbohidrazid osmiyum tetroksit ve tanik asit dahil edilerek uranil asetat ve osmiyum tetroksit varlığında aldehit fiksasyonunu kullanır.
Günümüzde, kimyasal fiksasyon, biyolojik numunelerin FIB-SEM analizi için araştırmacılar arasında en yaygın kullanılan fiksasyon tekniğidir ve yüksek çözünürlüklü görüntüler çok küçük bir mesafeden kaydedilebilir. FIB-SEM araştırmalarının büyük çoğunluğu kimyasal fiksasyona dayanmaktadır. Örneğin, hayvan karaciğer doku hücresi FIB-SEM altında incelenmiş, % 1.5 K3Fe3 + (CN) 6 ve % 20 glutaraldehit ile modifiye edilmiştir. % 2 OsO4 kimyasal karışımı ile 120 dakika süreyle fosfat tamponunda kimyasal olarak sabitlenmiştir. Oda sıcaklığında % 2 uranil asetat (sulu) ile fazladan boyama yapılmıştır.
Yüksek basınçlı dondurma ve donma ikamesi
Kriyomikroskopi için numunelerin kriyoimmobilizasyonu, kimyasal fiksasyon ve metalik lekeler olmadan alt hücresel yapıyı incelemek için benzersiz fırsatlar sunar. Biyolojik örnekler, oda sıcaklığında çok net görüntüler için FIB-SEM altında incelenebilse de, donma ikamesi (FS) yalnızca örneklerin yüksek iletkenliğine ve yüksek kontrastlı görüntülere katkıda bulunur. Aynı zamanda reçine ile gömüldüğünde ultra küçük yapıların korunmasına da yardımcı olur. Çünkü FS işleme sırasında, sinyal-gürültü oranını azaltmak için organik çözücüye çeşitli istenen kimyasallar ve metalik maddeler konulabilir. Bu da FIB-SEM incelemesinde şarj etkisinde düşüşe neden olur.
Bu güne kadar, FIB-SEM örnek hazırlama için çok az sayıda yüksek basınçlı dondurma (HPF) ve FS çalışması yapılmıştır. Yapılan vir çalışmada, HPF ve FS tekniklerini kapsayan 24 farklı hazırlama protokolü kullanılmıştır. Hücrelerin kontrastı ve yapısında önemli bir fark bulunmamıştır. Başka bir çalışma, kimyasal olarak ve FS/HPF ile sabitlenmiş fare karaciğer hücre örnekleri arasında karşılaştırmalı bir araştırma yapılmıştır. TEM için ise sulu veya susuz uranil asetat ve OsO4 içeren bir glutaraldehit ve metil alkol veya aseton karışımı kullanılmıştır.
Baş bir çalışmada ise SEM ve TEM görüntüleri arasındaki kontrast farkının fiksatifler, katkı metalleri ve boyama ajanlarından kaynaklanabileceğini öne sürülmüştür. Sonuç olarak FIB-SEM, FIB-TEM ve FIB-EDS’nin, materyallerin ve biyolojik örneklerin tomografik çalışmalarının yanı sıra karakterizasyon için günümüzde kullanılan en son teknikler olduğu sonucuna varılmıştır.
Kaynakça:
https://www.researchgate.net/publication/337323641_Focused_Ion_Beam_Tomography
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6993138/
Yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu