Bilgiustam
Türkiye'nin Bilgi Sitesi

Sitotoksisite ve Hücre Canlılığı Deneylerinde Kolorimetrik Testler

0 36

Kolorimetrik testlerin prensibi, hücrelerin metabolik aktivitesini değerlendirmek için bir biyokimyasal markörün ölçülmesidir. Kolorimetrik testlerde kullanılan reaktifler, hücrelerin canlılığına yanıt olarak bir renk geliştirerek, hücre canlılığının spektrofotometre ile kolorimetrik ölçümüne izin verir. Bu testler, yapışan veya asılı hücre hatları için uygulanabilir, gerçekleştirmesi kolay ve karşılaştırmalı olarak ekonomiktir. Ticari kolorimetrik analiz kitleri birkaç şirketten temin edilebilir ve genellikle bu testlerin deneysel prosedürleri kit paketlerinde mevcuttur.

MTT Testi

MTT (3- (4,5-dimetiltiyazol-2-il) -2-5-difeniltetrazolyum bromür) testi, sitotoksisiteyi veya hücre canlılığını değerlendirmek için en sık kullanılan kolorimetrik testlerden biridir. Bu tahlil, temel olarak süksinat dehidrojenaz gibi mitokondriyal enzimlerin aktivitesini ölçer. Aynı zamanda hücrelerin mitokondriyal fonksiyonunun belirlenmesi yoluyla hücre canlılığını belirler. Bu tahlilde MTT, NADH tarafından mor bir formazana indirgenir. Bu ürün, belirli bir dalga boyunda ışık soğurması ile ölçülebilir.

Avantajları

Sitotoksisite ve Hücre Canlılığı Deneylerinde Kolorimetrik TestlerBu yöntem daha önce bahsedilen boya dışlama yöntemlerinden çok daha üstündür. Çünkü kullanımı kolaydır, güvenlidir, yüksek tekrarlanabilirliğe sahiptir ve hem hücre canlılığını hem de sitotoksisite testlerini belirlemek için yaygın olarak kullanılır.

Dezavantajları

MTT formazan suda çözünmez ve hücrelerde mor iğne şeklinde kristaller oluşturur. Bu nedenle, absorbansın ölçülmesinden önce, kristalleri çözündürmek için dimetil sülfoksit (DMSO) veya izopropanol gibi organik bir çözücü gerekir. Ek olarak, MTT formazanın sitotoksisitesi, MTT formazan iğneleri ile yüzen hücreler nedeniyle hücre kültürü ortamının plaka kuyularından çıkarılmasını zorlaştırarak, kuyudan kuyudan kuyruğa önemli bir hata verir.
Partiküllerin dâhil edilmesinden kaynaklanan arka plan girişiminden kaynaklanan yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçları azaltmak için ek kontrol deneyleri yapılmalıdır. Bu müdahale, hücre canlılığının fazla tahmin edilmesine yol açabilir. Bu genellikle partiküllerin varlığında, ancak tahlil reaktifleri olmadan hücrelerin arka plan absorbansının çıkarılmasıyla kontrol edilebilir.

MTS Testi

MTS testi (5- (3-karboksimetoksifenil) -2- (4,5-dimetil-tiyazol) -3- (4-sülfofenil) tetrazolyum, iç tuz deneyi) bir kolorimetrik testtir. Bu tahlil, bir tetrazolyum tuzunun canlı hücrelerin mitokondriyal aktivitesi ile renkli bir formazana dönüştürülmesine dayanmaktadır. Üretilen formazan miktarı kültürdeki canlı hücre sayısına bağlıdır ve 492 nm’de spektrofotometre ile ölçülebilir.

Avantajları

Yapılan önceki çalışmalar, MTS in vitro sitotoksisite testinin kullanım kolaylığı, kesinlik ve toksisitenin hızlı göstergesi açısından iyi bir ölçüm sisteminin tüm özelliklerini birleştirdiğini ileri sürmektedir. MTS testi, hızlı, duyarlı, ekonomik ve spesifik bir in vitro sitotoksisite testidir. Bu testin performansı, diğer toksikolojik testlere göre çok rekabetçidir. Bu tahlil, sitotoksisite ölçümü için ideal özellikler sağlar çünkü kullanımı kolay, hızlı, güvenilir ve ucuzdur. Bu nedenle, yerinde toksikolojik değerlendirmeler için kullanılabilir.

Dezavantajları

492 nm’de ölçülen absorbans seviyesi, inkübasyon süresi, hücre tipi ve hücre sayısından etkilenir. MTS saptama reaktiflerinin kültürdeki hücrelere oranı da ölçülen absorbans seviyesini etkiler. Önceki çalışmalar, 5 saate kadar kısa inkübasyon süreleri için inkübasyon süresi ile absorbans arasında doğrusal bir ilişki olduğunu ileri sürmüştür. Bu nedenle, bu test için uygun inkübasyon süreleri 1–3 saattir.

XTT Testi

Sitotoksisite ve Hücre Canlılığı Deneylerinde Kolorimetrik TestlerMTT, emiciliğini ölçmek için boyanın çözülmesini gerektiren suda çözünmeyen bir formazan bileşiği üretirken, XTT suda çözünür bir boya üretir. XTT prosedürü basitçe proliferasyonu ölçmek içindir, bu nedenle hücrelerin miktarının belirlenmesi ve canlılıklarının belirlenmesi için mükemmel bir çözümdür. XTT, farklı büyüme faktörlerine yanıt olarak hücre proliferasyonunu test etmek için kullanılır. Ayrıca sitotoksisiteyi değerlendirmek için de kullanılır.
Bu tahlil, tetrazolyum tuzu XTT’nin metabolik aktif hücreler tarafından turuncu renkli formazan bileşiklerine indirgenmesine dayanmaktadır. Turuncu renkli formazan suda çözünür ve yoğunluğu spektrofotometre ile ölçülebilir. Formazanın yoğunluğu ile canlı hücre sayısı arasında doğrusal bir ilişki vardır. Çok oyuklu plakaların ve bir spektrofotometrenin veya ELISA okuyucunun kullanılması, çok sayıda örnekle çalışmaya, sonuçları kolay ve hızlı bir şekilde elde etmeye izin verir. Bu testin prosedürü, 96 kuyucuklu bir plakada hücre kültivasyonunu, XTT reaktifini eklemeyi ve 2-24 saat inkübasyonu içerir. İnkübasyon süresi sırasında turuncu bir renk oluşur ve renk yoğunluğu bir spektrofotometre ile ölçülebilir.

Avantajları

XTT testi hızlı, duyarlı, kullanımı kolay ve güvenli bir yöntemdir. Ayrıca yüksek hassasiyet ve doğruluğa sahiptir.

Dezavantajları

XTT test performansı, mitokondriyal dehidrojenaz aktivitesi olan canlı hücrelerin indirgeme kapasitesine bağlıdır. Bu nedenle son absorbans okumasını etkileyebilecek bazı faktörler vardır ve bunlar aşağıdaki gibidir:
• Enzimatik düzenleme,
• PH,
• Hücresel iyon konsantrasyonu (örneğin, sodyum, kalsiyum, potasyum),
• Hücre döngüsü varyasyonu
• Diğer çevresel faktörlerden kaynaklanan canlı hücrelerin indirgeme kapasitesindeki değişiklikler.

WST-1 Testi

WST-1 (2- (4-iyodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disülfofenil) -2 H tetrazolyum monosodyum tuzu) hücre proliferasyon testi, bağıl değeri ölçmek için tasarlanmış basit, kolorimetrik bir testtir. Suda çözünür tuz, hücre kültürü ortamına salınır. İnkübasyon süresi içinde reaksiyon, hücre kültüründeki mitokondriyal dehidrojenaz miktarı ile doğru orantılı bir renk değişikliği üretir. Bu nedenle tahlil, hücrelerin metabolik aktivitesini ölçer. Testi gerçekleştirmek için, kullanıma hazır olan WST-1 reaktifi, çok oyuklu plakalarda kültürlenen hücrelerin ortamına doğrudan eklenir. Kültürlere daha sonra reaktifi boya formuna indirgemek için 30 dakika-4 saat verilir. Plaka daha sonra 630 nm’de bir referans okuma ile 450 nm’de hemen okunur.

Avantajları

Kullanımı kolaydır, güvenlidir, yüksek tekrarlanabilirliğe sahiptir ve hem hücre canlılığını hem de sitotoksisite testlerini belirlemek için yaygın olarak kullanılır. Ayrıca hücre kültürü ortamındaki fenol kırmızısı indikatörleri, boya reaksiyonuna müdahale etmez. Deney sonunda üretilen renkli boya suda çözünür olduğu için solvent ve ek inkübasyon süresi gerektirmez.

Dezavantajları

WST-1 süresinin standart inkübasyon süresi 2 saattir. WST-1’in tek seferlik eklenmesinin, test ajanlarının farklı zaman noktalarında bağıl hücre canlılığı eğilimi üzerindeki etkisini yansıtıp yansıtmayacağı hala belirsizdir.

WST-8 Testi

WST-8 testi, canlı hücre sayılarının belirlenmesi için bir kolorimetrik testtir ve hücre çoğalması testlerinin yanı sıra sitotoksisite testleri için de kullanılabilir.
WST-8, bir yüksek derecede kararlı ve suda çözünür, Hücre Sayım Kiti-8’de (CCK-8) kullanılmaktadır. Özellikle nötr pH’da WST-1’den daha hassastır. Elektron mediatörü nedeniyle, bu kitteki 1-metoksi PMS oldukça stabildir, CCK-8, oda sıcaklığında en az 6 ay ve 0–5 o C’de 1 yıl stabildir. WST-8’den beri, WST- 8 formazan ve 1-metoksi PMS, kültür ortamındaki hücreler üzerinde sitotoksisiteye sahip değildir.

Avantajları

WST-8 hücre geçirgen değildir, bu da düşük sitotoksisiteye neden olur. Bu nedenle, tahlilden sonra, aynı hücreleri kullanarak başka deneylere devam etmek mümkündür. Dahası, hücresel indirgeme üzerine suda çözünür formazanı üretir, bu da daha basit bir tahlil prosedürüne izin vererek yönteme ek bir avantaj sağlar ve formazanı çözmek için ekstra bir adım gerektirmez.

Dezavantajları

Önemli bir husus, tahlil substratlarının azalmasının, genel hücre canlılığı üzerinde doğrudan bir etkisi olmayan hücre içi metabolik aktivitedeki değişikliklerden etkilenmesidir.

LDH Testi (Laktat Dehidrojenaz)

Sitotoksisite ve Hücre Canlılığı Deneylerinde Kolorimetrik TestlerLDH (laktat dehidrojenaz) sitotoksisite testi, hücresel sitotoksisiteyi test etmek için kolorimetrik bir yöntemdir. Test kiti, yalnızca hücre aracılı sitotoksisiteyi test etmek için kullanılmamaktadır. Ayrıca, toksik kimyasalların ve diğer test bileşiklerinin aracılık ettiği sitotoksisitenin değerlendirilmesi için farklı hücre tipleri ile kullanılabilir. Test, stabil, sitosolik, laktat dehidrojenaz (LDH) enzimini kantitatif olarak ölçer ve bu enzim hasarlı hücrelerden salınır.
LDH, normalde hücre sitoplazmasında bulunan bir enzimdir. Hücre canlılığı azaldığında plazma membranının sızdırması artar ve bu nedenle LDH enzimi hücre kültürü ortamına salınır. Salınan LDH, bir tetrazolyum tuzunun diyaforaz tarafından kırmızı renkli bir formazana dönüştürülmesiyle sonuçlanan bir bağlı enzimatik reaksiyonla ölçülür. İlk adımda, + . İkinci bir aşamada, katalizör (diyaforaz), H / H + ‘ yı NADH / H +’ dan tetrazolyum tuzu 2- (4-iyodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-feniltetrazolyum klorüre (INT) aktarır.
LDH aktivitesi, belirli bir süre boyunca NADH oksidasyonu veya INT azalması olarak belirlenir. Elde edilen kırmızı formazan, 492 nm’de maksimum emer ve kantitatif olarak 490 nm’de ölçülebilir. Deterjan Triton X-100, hücrelerden maksimum LDH salımını belirlemek için LDH testinde pozitif kontrol olarak yaygın olarak kullanılır. Ek olarak, kristalin silika gibi iyi bilinen membranolitik partiküller LDH testinde pozitif kontrol olarak kullanılabilir.

Avantajları

Güvenilirlik, hız ve basit değerlendirme, bu testin özelliklerinden bazılarıdır. Çünkü hücre içi LDH’nin kaybı ve kültür ortamına salınması, hücre zarı hasarına bağlı geri dönüşümsüz hücre ölümünün bir göstergesidir.

Dezavantajları

Bu tahlilin ana sınırlaması, serum ve diğer bazı bileşiklerin doğal LDH aktivitesine sahip olmasıdır. Örneğin, fetal buzağı serumu son derece yüksek arkaplan okumalarına sahiptir. Bu nedenle, bu tahlil serumsuz veya düşük serum koşullarıyla sınırlıdır, tahlil kültür süresini sınırlandırır ve tahlil kapsamını azaltır. Çünkü artık neden olduğu hücre ölümünün belirlenmesine izin veremez.

SRB (Sulforhodamine B) Testi

SRB (Sulforhodamine B) testi, hem bağlı hem de süspansiyon hücre kültürlerinde ilaca bağlı sitotoksisiteyi ölçmek için hızlı ve hassas bir kolorimetrik yöntemdir. İlk olarak Skehan ve meslektaşları tarafından açıklanan bu deney, 1985 yılında başlatılan Ulusal Kanser Enstitüsü’nün (NCI) hastalığa yönelik, büyük ölçekli antikanser ilaç keşif programında kullanılmak üzere geliştirilmiştir. SRB, iki sülfonik içeren parlak pembe bir aminoksanten boyadır. Hafif asidik koşullar altında, SRB, duyarlı bir hücresel protein indeksi sağlamak için TCA ile sabitlenmiş (trikloroasetik asit) hücrelerdeki protein bazik amino asit kalıntılarına bağlanır. SRB testi, koloni oluşumunu ve koloni yok oluşunu değerlendirmek için de kullanılır.

Avantajları

SRB testi basit, hızlı ve hassastır. Hücre sayısı ile iyi bir doğrusallık sağladı, doymuş boya konsantrasyonlarının kullanımına izin verir ve çevresel dalgalanmalara daha az duyarlıdır. Ayrıca ara metabolizmadan bağımsızdır ve ilk reaksiyon hızının zamana duyarlı bir ölçümünü gerektirmeyen sabit bir son nokta sağlar, bu testin tekrarlanabilirliği yüksektir.

Dezavantajları

Homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek ve sürdürmek önemlidir. Yüksek test performansı için hücresel kümelerden / agregalardan kaçınılmalıdır.

NRU (Nötr Kırmızı Alım) Testi

Nötr kırmızı alımı (NRU) testi ayrıca en çok kullanılan kolorimetrik sitotoksisite ve hücre canlılığı testlerinden biridir. Bu tahlil Borenfreund ve Puerner tarafından geliştirilmiştir . Bu tahlil, canlı hücrelerin supravital boya nötr kırmızıyı alma kabiliyetine dayanır. Bu zayıf katyonik boya, iyonik olmayan pasif difüzyonla hücre zarlarına nüfuz eder ve lizozomlarda yoğunlaşır. Boya daha sonra asitleştirilmiş etanol çözeltisi kullanılarak canlı hücrelerden ekstrakte edilir ve boyanın absorbansı spektrofotometre kullanılarak ölçülür.
Nötr kırmızı alımı, hücrelerin ATP üretimi boyunca pH gradyanlarını sürdürme kapasitesine bağlıdır. Fizyolojik pH’ta, boyanın net yükü sıfırdır ve bu yük, boyanın hücre zarlarına nüfuz etmesini sağlar. Lizozomların içinde, pH’ı sitoplazmanınkinden daha düşük tutmak için bir proton gradyanı vardır. Böylece boya yüklü hale gelir ve lizozomlar içinde tutulur. Hücre öldüğünde veya pH gradyanı azaldığında, boya tutulamaz. Ek olarak, canlı hücreler tarafından nötr kırmızının alımı, hücre yüzeyinde veya lizozomal membranlarda değişikliklerle modifiye edilebilir. Böylelikle canlı, hasarlı veya ölü hücreleri ayırt etmek mümkündür. Nötr kırmızı boyanın lizozomal alımı, hücre canlılığının oldukça hassas bir göstergesidir. Test, hücre canlılığını ölçebilir ve tohumlama yoğunluğuna bağlı olarak hücre replikasyonunu, sitostatik etkileri veya sitotoksik etkileri ölçebilir. Absorbans, çok oyuklu plaka okuyucu spektrofotometrede 540 nm’de ölçülür.

Avantajları

NRR testi, lizozomal hasarın iyi bir belirtecidir, ayrıca, hız ve basit değerlendirme, bu testin bazı avantajlarıdır.

Dezavantajları

NRR testinin, sıcaklık ve tuzluluk gibi doğal faktörlerden ya minimal düzeyde etkilendiği ya da hiç etkilenmediği, ancak esas olarak kirleticilerden etkilendiği bildirilmiştir.

CVS Testi (Kristal Mor Testi)

Yapışık hücreler, hücre ölümü sırasında hücre kültürü plakalarından ayrılır. Bu özellik, hücre ölümünün dolaylı değerlendirmesi ve sitotoksik ajanlarla stimülasyon üzerine proliferasyon oranındaki farklılıkları belirlemek için kullanılabilir. Hücrelerin korunan yapışmasını saptamanın basit bir yöntemi, kristal mor testidir. Bu tahlilde, kristal mor boya, canlı hücrelerin proteinlerine ve DNA’sına bağlanır, böylece, bağlanan hücreler bu boya ile boyanır. Hücreler, hücre ölümü sırasında bağlılıklarını yitirir ve daha sonra hücre popülasyonundan kaybolur, bu da bir kültürdeki kristal mor boyama miktarını azaltır. Kristal mor testi, kemoterapötiklerin veya diğer bileşiklerin hücre hayatta kalması ve büyüme inhibisyonu üzerindeki etkisinin incelenmesi için uygun olan hızlı ve güvenilir bir tarama yöntemidir.

Avantajları

Kristal mor boyama, çeşitli stimülasyon koşulları altında hücre canlılığını taramak için hızlı ve çok yönlü bir testtir. Bununla birlikte, hücre ölümü tepkileri ile aynı zamanda meydana gelen çoğalma tepkileri tarafından potansiyel olarak tehlikeye atılır. Bu nedenle, kaspazların veya nekroptozun kimyasal inhibitörleri teste dahil edilebilir. Alternatif olarak, hücre ölümünün doğasını daha spesifik olarak ele almak için moleküler çalışmalar örneğin aşırı ekspresyon veya yıkım için yapılabilir.

Dezavantajları

Kristal mor testi, hücre metabolik aktivitesindeki değişikliklere duyarlı değildir. Bu nedenle, bu tahlil, hücre metabolizmasından etkilenen bileşiklerin kullanıldığı çalışmalar için uygun değildir. Kristal mor testi, kemoterapötiklerin veya diğer bileşiklerin hücre hayatta kalması ve büyümenin engellenmesi üzerindeki etkisinin incelenmesi için uygun olsa da, hücre proliferasyon oranını ölçemez.

Kaynakça:
ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27509942
sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123918604000033

Yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu

Bunları da beğenebilirsin

Cevap bırakın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak.

Bu web sitesi deneyiminizi geliştirmek için çerezleri kullanır. Bununla iyi olduğunuzu varsayacağız, ancak isterseniz vazgeçebilirsiniz. Kabul etmek Mesajları Oku