Hücre canlılığı ve sitotoksisitenin florometrik tahlilleri, floresan mikroskobu, florometre, floresan mikroplaka okuyucu veya akış sitometresinin kullanımıyla kolayca gerçekleştirilebilir. Ve geleneksel boya dışlama ve kolorimetrik tahlillere göre birçok avantaj sunar. Florometrik testler ayrıca yapışan veya süspansiyon halindeki hücre hatları için de uygulanabilir ve kullanımı kolaydır. Bu testler, kolorimetrik testlerden daha duyarlıdır. Ticari florometrik analiz kitleri birkaç şirketten temin edilebilir ve genellikle bu analizlerin deneysel prosedürleri kit paketlerinde mevcuttur.
AlamarBlue (AB) Testi
AlamarBlue testi ayrıca resazurin indirgeme testi olarak da bilinir. Bu test, mitokondriyal ve diaforazlar gibi diğer enzimler tarafından pembe floresan resorufine dönüştürülen mavi floresan olmayan boya resazurinin dönüşümüne dayanır.
Resazurin, tetrazolyum bileşiklerini kullananlara benzer protokollerle canlı hücre sayısını izlemek için kullanılabilen fenoksazin-3-on boya ve hücre geçirgen redoks göstergesidir. Elektron alıcısı olarak moleküler oksijeni ikame ederek, oksijen ve sitokrom oksidazın son indirgenmesi arasındaki elektron taşıma zincirinde bir ara elektron alıcısı olarak hareket ettiği bilinmektedir. Toksik olmayan ve hücre geçirgen bir bileşik olduğundan rengi mavidir ve floresan değildir. Hücrelere girdikten sonra resazurin, resorufine indirgenen kırmızı renkli ve oldukça floresan bir bileşiktir. Canlı hücreler sürekli olarak resazurini resofurine dönüştürerek hücre kültürü ortamının genel floresansını ve rengini artırır. Üretilen resofurin miktarı, canlı hücrelerin sayısı ile ilgilidir. Canlı hücrelerin oranı, 560 nm eksitasyon/590 nm emisyon filtre seti ile donatılmış bir mikroplaka okuyucu florometre kullanılarak ölçülebilir. Resofurin, absorbans değişiklikleri ile de ölçülebilir, ancak absorbans deteksiyonu sıklıkla kullanılmaz çünkü absorbans deteksiyonu flüoresan ölçümünden daha az duyarlıdır.
Arka planın üzerinde yeterli bir floresan sinyali oluşturmak için gereken inkübasyon süresi, hücrelerin metabolik aktivitesine, kuyucuk başına hücre yoğunluğuna ve kültür ortamı tipi gibi diğer koşullara bağlı olarak genellikle yaklaşık 1-4 saattir.
Avantajları
AlamarBlue (resazurin indirgeme) testi nispeten ucuzdur ve tetrazolyum testlerinden daha hassastır. Ayrıca, sitotoksisite mekanizması hakkında daha fazla bilgi toplamak için kaspaz aktivitesinin ölçülmesi gibi diğer yöntemlerle çoğaltılabilir.
Dezavantajları
Test bileşiklerinden floresan müdahalesi ve hücreler üzerinde sıklıkla gözden kaçan doğrudan toksik etkiler mümkündür.
CFDA-AM Testi
CFDA-AM (5-karboksifloresein diasetat, asetoksimetil ester), sitotoksisite tayini için kullanılan başka bir florojenik boyadır ve plazma membran bütünlüğünün göstergesidir. Boya CFDA-AM, canlı hücrelerin spesifik olmayan esterazları tarafından membran geçirgen, polar olmayan, floresan olmayan bir maddeden polar, floresan boya, karboksifloreseine (CF) dönüştürülebilen toksik olmayan esteraz substratıdır. Hücreler tarafından CFDA-AM’nin CF’ye dönüşümü plazma membranının bütünlüğünü gösterir. Çünkü sadece sağlam bir membran esteraz aktivitesini desteklemek için gerekli olan sitoplazmik ortamı koruyabilir.
Avantajları
CFDA-AM ve alamar Blue testlerinin, her ikisi de hücreler için zararlı değildir. Ve aynı zamanda inkübasyon süreleri aynıdır ve değişik dalga boylarında müdahale gerektirmediği belirlendiğinden aynı hücre setine paralel olarak işlem yapılabileceği belirlenmiştir.
Dezavantajları
Test bileşiklerinden flüoresan girişimi mümkündür.
Proteaz Canlılık Markör Testi (GF-AFC Testi)
Canlı hücrelerin korunmuş ve yapıcı bir proteaz enzim aktivitesinin ölçümü, hücre canlılığının iyi bir göstergesi olarak kullanılır. Canlı hücrelerle sınırlı proteaz aktivitesini seçici olarak saptamak için son zamanlarda hücre geçirgen bir florojenik proteaz substratı (glisilfenilalanil-aminoflorokumarin; GF-AFC) geliştirilmiştir. GF-AFC substratı canlı hücrelere nüfuz edebilir. Bu hücrelerde sitoplazmik aminopeptidaz aktivitesi, aminoflorokumarin (AFC) salmak için gly ve phe amino asitlerini uzaklaştırırken canlı hücrelerin sayısı ile orantılı bir floresan sinyal üretir.
Hücreler öldüğünde, bu proteaz aktivitesi hızla kaybolur. Bu nedenle, bu proteaz aktivitesi, canlı hücre popülasyonunun seçici bir işaretleyicisidir. Bu tahlil yaklaşımından üretilen sinyalin, bir ATP tahlili gibi hücre canlılığını belirlemeye yönelik diğer yerleşik yöntemlerle iyi korelasyon gösterdiği gösterilmiştir.
Avantajları
Kültürdeki hücreler için nispeten toksik değildir. Ayrıca, hücrelerin tetrazoliuma maruz kalmasının tersine, GF-AFC substrat hücrelerinin uzun süreli maruz kalması, hücrelerin canlılığında çok az değişikliğe neden olur. Bu tahlil, diğer tahlillerle çoğullamaya uygundur, çünkü tahlilin sonunda hücre popülasyonu canlı kalır ve sonraki tahliller için kullanılabilir. Ayrıca inkübasyon süresi, tetrazolyum testleri için gereken 1-4 saate kıyasla çok daha kısadır (30 dakika-1 saat).
Dezavantajları
Test bileşiklerinden flüoresan girişimi mümkündür.
Luminometrik Testler
Luminometrik testler, memeli hücrelerinde hücre proliferasyonunun ve sitotoksisitenin hızlı ve basit bir şekilde belirlenmesini sağlar. Bu testler uygun bir 96 ve 384 kuyucuklu mikrotitre plaka formatında yapılabilir ve luminometrik mikroplaka okuyucu ile tespit edilebilir. Luminometrik tahlillerin dikkate değer bir özelliği, reaktif ilavesinden sonra üretilen kalıcı ve kararlı kızdırma tipi sinyaldir. Bu özellik, aynı kuyudan hem canlılık hem de sitotoksisite değerleri üretmek için kullanılabilir. Luminometrik analizlerin ticari kitleri birkaç şirketten temin edilebilir ve genellikle bu tahlillerin deneysel prosedürleri kit paketlerinde mevcuttur.
ATP Testi
ATP (adenozin tri-fosfat), hücrelerdeki en önemli kimyasal enerji rezervuarını temsil eder ve biyolojik sentez, sinyal verme, taşıma ve hareket süreçleri için kullanılır. Bu nedenle hücresel ATP, hücre canlılığını ölçmede en hassas uç noktalardan biridir. Hücreler ölümcül bir şekilde hasar gördüğünde ve membran bütünlüğünü yitirdiğinde, ATP’yi sentezleme yeteneğini kaybeder ve hücrelerin ATP seviyesi dramatik olarak düşer. ATP testi, lusiferinin oksilusiferine reaksiyonuna dayanır. Enzim lusiferaz, bu reaksiyonu Mg2 + iyonları ve ATP varlığında katalize ederek bir ışıldayan sinyal verir. Lüminesan sinyal yoğunluğu ile ATP konsantrasyonu arasında doğrusal bir ilişki veya hücre numarası vardır.
ATP tahlil kimyası tipik olarak kuyu başına 10 hücreden daha azını tespit edebilir ve bu nedenle 1536-çukurlu plaka formatında yaygın olarak kullanılmaktadır.
Avantajları
ATP testi, kullanılacak en hızlı hücre canlılığı testidir, en duyarlıdır ve diğer canlılık testlerinden daha az yapaydır. Lüminesan sinyal sabit duruma ulaşır ve reaktif eklendikten sonra 10 dakika içinde stabilize olur. Substratın renkli bileşiğe dönüştürülmesi için bir inkübasyon aşaması yoktur. Bu aynı zamanda bir plaka işleme adımını da ortadan kaldırır.
Dezavantajları
ATP test hassasiyeti genellikle test kimyasının bir sonucundan ziyade tekrarlanan örneklerin pipetlenmesiyle sınırlıdır.
Gerçek Zamanlı Canlılık Testi
Son zamanlarda, canlı hücre sayısını gerçek zamanlı olarak ölçmek için yeni bir yaklaşım geliştirilmiştir. Bu tahlilde, bir deniz karidesinden türetilmiş tasarlanmış bir lusiferaz ve küçük bir moleküllü prosubstrat kullanılır. Ön substrat ve lusiferaz, doğrudan bir reaktif olarak hücre kültürü ortamına eklenir. Ön substrat, bir lusiferaz substratı değildir. Aktif bir metabolizmaya sahip canlı hücreler, ön-substratı, lüminesan bir sinyal oluşturmak için lusiferaz tarafından kullanılan bir substrata indirger. Test sürekli okuma ve son nokta ölçümü olarak iki formatta gerçekleştirilebilir. Sürekli okuma formatında, gerçek zamanlı hücre sayısını ölçmek için lüminesan sinyal numune kuyularından tekrar tekrar kaydedilebilir.
Avantajları
Bu test, hücre canlılığı ve sitotoksisitesinin gerçek zamanlı ölçümüne izin veren tek testtir. Hücre ölümünü takiben ışıldayan sinyaldeki hızlı düşüş, bu tahlilin, hücreleri öldürecek bir parçalama aşaması içeren diğer ışıldayan tahlillerle çoklanmasını sağlar. Hücre ölümünü takiben lüminesanstaki azalma, sonraki lüminesan testlerle etkileşimi ortadan kaldırmak için önemlidir.
Dezavantajları
Gerçek zamanlı tahlilin bir sınırlaması, pro-substratın metabolik olarak aktif hücreler tarafından nihai tükenmesinden kaynaklanır. Genel olarak, üretilen ışıldayan sinyal, metabolik olarak aktif hücrelerin sayısı ile ilişkilidir. Bununla birlikte, lüminesan sinyalin hücre sayısı ile doğrusal olacağı sürenin uzunluğu, oyuk başına hücre sayısına ve bunların metabolik aktivitesine bağlıdır. Bu nedenle, doğrusallığı korumak için maksimum inkübasyon süresinin her hücre tipi ve tohumlama yoğunluğu için ampirik olarak belirlenmesi önerilmektedir.
3. Sonuçlar
Halihazırda toksikoloji ve farmakoloji alanlarında geniş bir sitotoksisite ve hücre canlılığı deneyleri yelpazesi kullanılmaktadır. İn vitro canlılık veya sitotoksisite tayini için ideal bir tahlil, hızlı, güvenli, güvenilir, verimli, zaman ve maliyet etkin olmalıdır. Test bileşiğine müdahale etmemelidir ve deney yönteminin seçimi, etkileşim türünün değerlendirilmesinde çok önemlidir. Tahlil, bileşik etkileşiminin yorumunu değiştirebilir. Bu nedenle test yöntemi, test bileşiğinin etki mekanizması dikkate alınarak dikkatle seçilmelidir. Çalışmada kullanılan doku veya hücre tipi ayrıca sitotoksisite ve hücre canlılığı deneylerinin performansını da etkiler. Bu nedenle, çalışma için bir test seçmeden önce, farklı yöntemler denenmeli ve karşılaştırılmalıdır. Mümkünse, in vitro çalışmalarda sitotoksisiteyi ve hücre canlılığını belirlemek için birden fazla test kullanılmalıdır. Böylece elde edilen sonuçların güvenilirliği artar.
Kaynakça:
ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27509942
sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123918604000033
Yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu