Viral metagenomik, biyolojik bir numunenin tüm viral genetik popülasyonlarını araştırmak için kullanılan kültürden bağımsız bir yaklaşımdır. Bu metodoloji, hayvanların zoonoza neden olabilecek virüs için bir rezervuar olarak kaldığı düşünülmektedir. Buda yeni ve ortaya çıkan virüsleri tanımlamak için güçlü bir araç haline gelmektedir. Sağlıklı ve hastalıklı bireylerde viral flora hakkında artan bilgi, hem hayvan hem de insan sağlığı için önemlidir. Bu bağlamda, virüslerin keşfi için metagenomik tahliller, temel olarak, yeni nesil dizileme platformları ve dizi analizi için biyoinformatik araçlarla kombinasyon halindedir. Buda klinik örneklerden nükleik asitlerin diziden bağımsız amplifikasyonuna dayanmaktadır. Nispeten basit ve hızlıdırlar, aynı anda yüzlerce virüsün, hatta daha önce tarif edilenlerden oldukça farklı olabilecek bilinmeyen virüslerin bile tespit edilmesine izin verirler.
Yüksek verimli sıralama teknolojisi, Roche 454, pyrosequencing’e dayanır; işlem hacmi 0,4-0,6 Gb/run ve 400 nt okuma değerindedir. Solexa/Illumina, tersinir sonlandırıcılara sahip bir sistem kullanır ve sıralama sistemine bağlı olarak 75-150 nt okuma uzunluğu ile daha yüksek bir iş hacmine (7,5 Gb–1,8 Tb/çalışma) sahiptir. SOLiD sistemi ligasyon ve bölünebilir problara dayanır. Verimi 80–320 Gb/run’dur, ancak yalnızca 50–75 nt okuma üretir ve bu da sıra analizini zorlaştırır. Bu teknolojiler, hayvan dokuları, böcekler, dışkıları ve oral sürüntüler gibi çeşitli örneklerden yeni ve bilinen virüslerin tespitine izin vermiştir. Bu yaklaşımla tanımlanan virüsler astrovirüs, bornavirüs, tornovirüs i, circovirustipo 2, parvovirüs, koronavirüs ve herpesvirüstür. Ek olarak, virüsün organ dokusundan tespiti, saflaştırılması ve zenginleştirilmesi için bazı protokoller de geliştirilmiştir. Kohl ve ekibi viral metagenomikler için doku temelli evrensel virüs tespiti adı verilen bir yöntem önermişlerdir. Bu yaklaşım, dört virüsten biriyle aşılanmış tavuk dokularında kullanılmıştır. Zarflı DNA virüsünü temsil eden poksvirüs (aşı virüsü), Reovirüs (Orthoreovirüs) zarfsız virüsler, ortomiksovirüsler (grip virüsleri), paramiksovirüsler ve RNA zarflı virüslerdir. Virüsler, viral olarak ortaya çıkan hastalıklara neden olma potansiyelleri nedeniyle özel olarak seçilmişlerdir. Geliştirilen protokol, doku homojenizasyonu, viral partiküllerin ayrılması için ultrasantrifüjleme, RNA ekstraksiyonu, amplifikasyon ve son olarak rastgele yeni nesil dizileme (NGS) gibi birkaç adımı dikkate almaktadır.
Oluşturulan protokol, virüsün hızlı, güvenilir saflaştırılmasına ve zenginleştirilmesine ve 100-1000 virüs kopyası/mL homojenize organ materyali duyarlılığı ile saptanabilir viral nükleik asitlerin miktarında bir artışa izin vermiştir. Metagenom projelerinden yeni viryonların tam genomlarının geri kazanılması için bir iş akışı geliştirilmiştir. Okumaların, istenen virüsten spesifik kontiglerin atanmasıyla uzun parçalar halinde birleştirilmesinden başlayarak birkaç aşama dikkate alınmıştır. Analiz daha sonra, geçici bir genom oluşturmak için diğer fragmanların tohum contigine bağlanmasına devam edebilir. Son olarak, tam uzunlukta bir viral genom elde edilir.
Metagenomik, hayvanlarda gastrointestinal hastalıklara neden olan virüsün tanımlanmasında ilgili bir yöntemdir. Zoonoz ile ilişkili olan metagenomik yaklaşımlarla çeşitli viromlar incelenmiştir. Örneğin, atların siphoviridae, myoviridae ve podoviridae gibi farklı fajlara sahip olduğu bildirilmiştir. Bu viral partiküller, gastrointestinal sistemde yaşayan bakteri popülasyonlarını kontrol edebilir. Öte yandan domuzlar, kobuvirüsler, enterovirüsler, sapelovirüsler, teschovirüsler, sapovirüsler, astrovirüsler, koronavirüsler, ayrıca bocavirüsler ve posavirüs 1 ve 2 (RNA virüsü) circoviridae ve parvoviridae ailelerine karşılık gelen viral sekanslar içerir. Bununla birlikte bazıları farklı hayvanlardaki hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Ek olarak, tavşanda tarif edilen bir vaka, enterik hastalık ile ilgili çok sayıda Astrovirüs sekansını ortaya çıkarmıştır. İshalli kedilerde bildirilen bir başka çalışmada, köpek parvovirüs 2 (CPV2), köpek enterik koronavirüs (CcoV), rotavirüs, böcek ve bitki virüsleri, köpek kobuvirüsleri ve sapovirüsler (köpek sapovirüsleri 1 ve 2) bulunabilir. Son olarak, kuş dışkılarından yapılan çalışmalar kobuvirüsler, kalisivirüs (Sapovirüs ve Lagovirüs), avianastrovirüs ve avian reovirüsü göstermiştir.
Metagenomik profiller, tıbbi önemi olan başlıca hematofaj artropodlarla ilişkili arbovirüslerin kapsamlı bir şekilde bilinmesine izin vermiştir. Flaviviridae, bunyaviridae, reoviridae, hepadnaviridae, rhabdoviridae ve togoviridae , kanla beslenen eklembacaklılar tarafından tespit edilen virüslerdir. Metagenomik çalışmalar, sivrisineklerde insana bulaşabilen veya zoonoz bulaştırabilen hayvan virüsleri bulmuştur. Anelloviridae, circoviridae, herpesviridae, poxviridae ve papillomaviridae, karışık tür dişi sivrisineklerde tespit edilmiştir. Anopheles sp, ochlerotatus sp, culex sp gibi diğer eklembacaklı türlerinde ve aedes sp, reoviridae, rhabdoviridae, bunyaviridae, flaviviridae ve togaviridae birkaç hayvan virüsü rapor edilmiştir. Eklembacaklıların viromu çok önemlidir çünkü insanlar ve eklembacaklılar ortak bir yaşam alanını paylaşırlar ve ciddi hastalıklara, hatta salgınlara neden olurlar. Metagenomik, artropodlarla ilişkili çok sayıda bilinen ve bilinmeyen böceğe özgü veya zoonotik ajanı ortaya çıkarmıştır. Eklembacaklıların RNA viromu üzerinde çalışılmaktadır; ancak sivrisinekler büyük ölçüde RNA virüslerini iletmektedirler.
Avustralya’daki sivrisineklerde yapılan metagenomik çalışmalar, edge hill virüsü, walla virüsü gibi hayvan virüslerinin ve keseli hayvanları enfekte edebilen diğer virüslerin varlığını ortaya çıkarmıştır. Aynı metagenomik profilde, ross river virüsü ve alphavirus gibi insanları enfekte eden virüsler tanımlanabilir. Alphavirüs, togaviridae ailesine aittir ve Avustralya’da influenza benzeri hastalık veya poliartritin ana etiyolojik ajanıdır. Bu metagenomik çalışmada ayrıca yeni bir virüs, dipteran-memeli ilişkili rabdovirüs: dimarhadbovirüs bildirilmiştir. Farklı virüs türlerini tespit etme yeteneğini artıran bu yeni metodolojiler, birçok zoonozun teşhisinde büyük ilgi görmektedir. Son 3 yılda yeni adenovirüsler keşfedilmiş ve bazıları insanlar için patojen olarak görülmüştür. Bu bulgular, bu türden birçok virüsün gelecekte keşfedilebileceğini göstermektedir. Bu virüslerin ana konağı olan kemirgen örneklerinden tespiti, insanlarda ortaya çıkan zoonotik hastalıkların oranını önlemek veya azaltmak için kontrol önlemleri oluşturmaktadır.
Virüslerin belirlenmesindeki diğer önemli gelişmeler Dacheux ve ekibi tarafından gösterilmiştir. Yukarıda belirtilen bazı teknolojileri kullanan bu çalışmada, insanlarla yakın temas halinde olan Fransız böcekçil beş farklı yarasa türünün viral çeşitliliğini belirlemişlerdir. Bu çalışmada açıklanan viromlar, bakterileri, bitkileri ve mantarları, böcekleri veya omurgalıları enfekte eden bilinen virüs ailelerinin varlığını ortaya çıkarmıştır. En ilgili gruplar, potansiyel olarak memelileri enfekte edenlerdir. Örneğin, retroviridae, herpesviridae, bunyaviridae, poxviridae, laviviridae, reoviridae, bornaviridae ve picobirnaviridaedır. Veriler, ilk yarasa nairovirüsünün tanımlanmasıyla birlikte rotavirüsler, gamaretrovirüsler, bornavirüsler ve bunyavirüsler dahil olmak üzere yeni memeli virüslerinin tespitini ortaya çıkarmıştır.
Yarasaların doğal olarak memelileri enfekte edebilecek virüsleri barındırdığını gösterdiği için büyük ilgi görmektedir. Bu doğal konakçılarda bilinen ve bilinmeyen virüslerin belirlenmesi, zoonotik viral enfeksiyonların yayılmasında yarasaların oynadığı rolü belirlemeye de izin vermektedir. Viral metagenomiklerin ilk kanıtı Breitbart ve ekibi tarafından yayınlanmıştır. Bu bölümde, yazarlar viral çeşitliliğin tamamen hafife alındığı sonucuna varmışlardır. Deniz ekosistemlerinde bulunan 7000’den fazla farklı viral genotip ile virüsler, doğadaki en bol ve çeşitli yaşam biçimi olarak kabul edilmektedir. Viral metagenomikler, farklı vücut bölgeleri ile ilişkili viral bileşimi ve DNA virüs toplulukları esas olarak incelenmiştir. Hayvanlarda viral metagenomik yaklaşımlar, belirli hayvan türlerinde yeni antibiyotik direnç genlerini, yeni virülans faktörlerini ve yeni genotipleri tanımlama fırsatı sunmaktadır. Örneğin, insanlarda kan örneklerinde bulunduğu gibi kesinlikle hayvandan yeni anellovirüs dizilerini kurtarır. Öte yandan, bakteriyofajlar her yerde bulunur ve insan vücudunda 10 13 ile 10 15 parçacık arasında bir tahminle herhangi bir ekosistemde yaygın olarak dağıtılır.
Örneğin, birkaç çalışmada tükürük, solunum yolu, gastrointestinal sistem ve orofaringeal örneklerde bakteriyofaj popülasyonları bildirilmiştir. Bakteri virüslerinin insandaki bakteri popülasyonlarının dinamiği üzerinde önemli bir rol oynadığı ve diğerleri arasında yatay gen transfer süreçleri üzerinde etkisi olduğu bilinmektedir. Bu anlamda, Breitbart ve Rohwer 2005 yılında bakteriyofajların insanlarda sağlıklı ve hastalık durumlarında önemli roller oynayabileceğini yayınlamışlardır. Patojenik bakterilerde yeni patojenik fenotip sağlayabilirler. Bu fenomeni hayvanlarda incelemek ilginç olabilir çünkü yeni teşhis deneyleri geliştirmeye, yeni patojenik faktörleri belirlemeye ve zoonoz için yeni tedaviler tasarlamaya izin vermektedir. Viral kompozisyonların metagenomik profilleri, insan orofarenksinin virülans genlerinin önemli bir rezervuarı olduğunu ileri sürmüştür. İnsanlarda bakteriyofajlardan bakterilere yatay gen transferinin güçlü kanıtları vardır. Çünkü kistik fibroz hastalarında incelenen bakteriyofajlarda antibiyotik direnç genleri bulunmuştur. Bu çalışmalar sadece insanlarda ve hayvanlarda viral bileşimi tanımlamaya izin vermekle kalmaz, aynı zamanda bilinen ve bilinmeyen virülans genlerinin, virüsler ve bakteriler arasındaki dinamiğin varlığını doğrulamaya ve yeni teşhis araçları tasarlamaya izin vermektedir.
Ortaya çıkan virüsleri incelemek için metagenomik yaklaşımlar başarıyla kullanılmıştır. Bu küresel araçlar, her ikisi de 2010 yılında Uganda’daki hemorajik ateşte sarıhumma virüsünü ve grip virüsünü incelemek için uygulanmıştır. Bu virüs hakkındaki bilgiler tamamen eksik olduğunda, metagenomikler grip virüsünün tüm genomunu aydınlatmaya izin vermiştir. Bu nedenle, metagenomiklerin yeni ortaya çıkan virüsü ve genomunu incelemek ve sonuç olarak bunların yayılmasını önlemek için önceden kontroller almak için önemli çıkarımları vardır. İnsanlarda ve hayvanlarda yapılan metagenomik çalışmalardan elde edilen sonuçlar, tanısal ilgiyle yeni ve sağlam moleküler tekniklerin geliştirilmesinde de olumlu etkiye sahiptir. İyi ve temsili bir numunenin toplanması metagenomik önerilerle gereklidir. Viral zenginleştirilmiş örnek, filtrasyon ve ultrasantrifüjleme ile elde edilebilir ve partiküller sükroz, gliserol veya sezyum klorür yoğunluk gradyanı ile saflaştırılır. Viral genom, prokaryotik ve ökaryotik hücrelerdekinden daha kısa olduğu için, bakterileri ve konakçı hücreleri uzaklaştırmak için filtrasyon gereklidir. Bununla birlikte, 0,2 m’lik filtreler kullanıldığında, numunede büyük virüsler tamamen eksiktir ve viral parmak izi hafife alınır. Dolayısıyla, metodolojik detaylar özel ilgi alanına göre ayarlanmalıdır.
Viral genomun amplifikasyonu genellikle nükleik asit ekstraksiyonlarından önce önerilir. Bağlayıcı ile güçlendirilmiş av tüfeği kütüphane yöntemi, viral genomları çoğaltmak için sıklıkla kullanılır. RNA virüslerinden elde edilen viral DNA veya cDNA parçalanmalı, bağlanmalı ve PCR ile amplifiye edilmelidir. Ancak bu tekniğin önemli bir dezavantajı vardır çünkü ssDNA viral genomları amplifiye edilemez ve son metagenomda eksiktir. RNA virüslerinden elde edilen DNA veya cDNA’nın izotermal amplifikasyonu, rasgele heksamer ve phi29 DNA polimeraz kullanılarak da tavsiye edilir. Bu metodolojiye çoklu yer değiştirme amplifikasyonu denir ve güçlendirilmiş av tüfeği kütüphanesi yöntemini birleştirmek için alternatif bir tekniktir.
Çoklu yer değiştirme amplifikasyonu tercihen ssDNA’dır. Kullanılan amplifikasyon yönteminin, metagenom hazırlığı ve dolayısıyla aşağı akış analizleri ve karşılaştırmaları üzerinde önemli bir etkiye sahip olacağına dikkat etmek önemlidir. Metagenom hazırlandıktan sonra, iyi ve doğru yorumlar yapmak için bir biyoinformatik iş akışı gereklidir. Bu iş akışı genel olarak dört adımı içerir: ön işleme, açıklama, montaj ve son olarak genotiplerin, bollukların, toplulukların, yapıların ve çeşitliliğin tahmini. Taksonomik sınıflandırma, viral metagenomiklerde aktif bir alan olarak tanımlanır. Diziyi taksonomik önerilerle sınıflandırmak için benzerliğe dayalı yöntemler ve bileşime dayalı yöntemler olarak iki ana yöntem kullanılır. Viral metagenomikler, çeşitli hastalıklar için patojen viral ajanları tanımlamamıza gerçekten izin vermiştir. Metagenomik araçlar ayrıca insanlar ve hayvanlar için başlangıçtaki viral çeşitliliği karakterize etmek için de yapılmıştır.
Kaynakça:
ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4100157/
ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7019290/
Yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu