Biyokimya Dehası Frederick Sanger Kimdir?

Kuşkusuz, Nobel Kimya Ödülü’nü kazanmak çok önemli bir başarıdır. Ama iki kez kazanmak çok nadir olarak görülebilen olağanüstü bir başarıdır. Frederick Sanger, ödülün tarihinde Nobel Ödülü’nü iki kez kazanabilmiş dört kişiden biridir ve üstelik aynı kategoride kazanabilmiş iki kişiden (diğeri fizikçi John Bardeen) biridir. Sanger, ilk Nobel Kimya Ödülü’nü 1958 yılında insülin dizileme çalışmaları nedeniyle aldı. Sanger’in araştırmalarından önce, proteinlerin açıkça tanımlanmış bir biçimden yoksun olduğu varsayılıyordu. Sanger, insülinin kimyasal dizilemesiyle, proteinlerin tanımlanmış bir kompozisyona sahip olduğunu kanıtladı. Ve, yirmi iki yıl sonra da, geliştirdiği çeşitli yeni dizileme yöntemlerini DNA’ya uygulayarak, 1980 yılında Paul Berg ve Walter Gilbert ile paylaştığı ikinci Nobel Kimya Ödülü’nü de kazandı. Nükleik asitlerdeki baz dizilimi, DNA molekülündeki timin (T), adenin (A), sitozin (C) ve guaninin (G) fiziksel düzenini belirledi ve Frederick Sanger’in bu keşfi, insan genomunun dizilemesinin gerçekleştirilmesini olanaklı kıldı.

İngiliz biyokimyacı Frederick Sanger, 13 Ağustos 1918’de, Rendcombe, Gloucestershire’da doğdu ve 19 Kasım 2013’te, Cambridge’de öldü. Sanger, bir tıp pratisyeni olan Frederick Sanger’in ve varlıklı bir pamuk üreticisinin kızı olan Cicely Crewsdon Sanger’in ortanca çocuğuydu. Ailesi, ısrarla babasının izinden gitmesini ve tıp doktoru olmasını istiyordu. Uzun süre düşündükten sonra bir bilim insanı olmaya karar veren Sanger, 1936’da Cambridge’deki St. John’s College’e girdi. Önce kimya ve fizik üzerine yoğunlaştı, ancak küçük yaşlarında çok önemsemediği matematik ve fizikte bilgi birikimi eksikliği nedeniyle zorlanınca, fizyoloji ve biyokimya alanlarına yöneldi. Öğreniminin ikinci yılında hem annesini hem de babasını kanserden kaybetti. Hristiyanlığın kueykır (quaker) mezhebinin etkisinde yetişmiş olduğundan, inancı nedeniyle savaşa karşı ve vicdani redçi olan Sanger,1940 yılında, Cambridge’in Savaşa Karşı Bilim İnsanları Grubu’nda tanıştığı Joan Howe ile evlendi ve çiftin Robin, Peter ve Sally Joan adlarında üç çocukları oldu. İkinci Dünya Savaşı sırasında da Cambridge’de biyokimyacı Albert Neuberger’le lisin metabolizması üzerinde çalışan Sanger, 1943 yılında doktorasını tamamladı.

İnsülin Dizileme Araştırmaları

Savaş nedeniyle, biyokimyacı Albert C. Chibnall ve protein araştırmaları grubu, Londra’daki yerinden (Imperial College of Science, Technology and Medicine) Cambridge’deki biyokimya bölümünün daha güvenli olan ortamına taşınmıştı. Protein araştırmacıları arasında tartışma konusu olan iki farklı yaklaşım vardı. Birinci yaklaşıma göre, proteinler, kimyasal analizlerle kolayca çözümlenemeyecek çok karmaşık karışımlardı. Chibnall, belirli bir proteini başlıbaşına bir kimyasal bileşik olarak kabul eden diğer yaklaşımı destekliyordu. Frederick Sanger gruba katıldığında, Chibnall insülin üzerindeki çalışmalarını sürdürüyordu. Chibnall’ın önerisi ile, Sanger, serbest – amino insülin gruplarını tanımlamak ve ölçmek için çalışmaya başladı.

Frederick Sanger, amino gruplarının sarı renkli türevlerini üretmek amacıyla dinitrofluorobenzen kullanan bir yöntem geliştirdi. Yeni bir ayırma metodu ile ilgili olarak kromatograf hakkındaki bilgiler henüz yayınlanmıştı ve Sanger, kariyerinde büyük etkisi olan, proteinin hidroliz ürünlerini ayırmada bu yeni tekniğin yararını hemen fark etmişti. İnsülinin, fenilalanin ve glisin olmak üzere iki tip zincirden oluştuğunu ileri süren, iki terminal amino grubunu tanımladı. Öğrencisi Rodney Porter ile birlikte, birçok proteinin amino terminal gruplarını incelemek için bu yeni yöntemi kullandılar. Rodney Porter daha sonra antikorların kimyasal yapısını belirlemedeki çalışmaları için 1972 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü’nü kazandı.

İnsülin zincirlerinin disülfür bağları ile bir arada tutulduğu varsayımı ile, Frederick Sanger zincirleri oksitledi ve iki fraksiyona ayırdı. Bir fraksiyonun amino ucunda fenilalanin; diğer fraksiyonunkinde ise glisin vardı. Tam asit hidrolizi, insülini amino asit bileşenlerine indirgerken, kısmi asit hidrolizi, farklı amino asitlerle insülin peptidlerini oluşturuyordu. Sanger, o günlerde tanıtılan başka bir teknik olan kağıt kromatografisi ile, her zincirin amino terminal peptidlerini dizileyebildi ve bu çalışması, ilk kez bir proteinin belirli bir noktada spesifik bir diziye sahip olduğunu gösterdi. Frederick Sanger ve Avusturyalı biyokimyacı Hans Tuppy, kısmi asit hidrolizinin ve enzimatik hidrolizin bir kombinasyonunu kullanarak, insülinin fenilalanin zincirindeki amino asitlerin tam dizisini belirlediler. Sanger, ayrıca Avustralyalı biyokimyacı E.O.P. Thompson ile birlikte sürdürdüğü diğer bir çalışmayla da glisin zincirinin dizisini de belirledi.

Şimdi yalnızca iki problem kalmıştı: Amid gruplarının dağılımı ve disülfür bağlarının yeri. 1954 yılında bu iki sorunun da yanıtlarını bulan Frederick Sanger, insülinin yapısını da tamamen çözmüş oldu. Bu çalışmasıyla, bir proteini dizeleyen ilk bilim insanı olarak 1958 Nobel Kimya Ödülü’nü aldı. Sanger ve çalışma arkadaşları, insülin ile ilgili araştırmalarına devam ederek diğer birçok türün dizilemelerinin sonuçlarıyla karşılaştırdılar. Yeni geliştirilmiş olan radyoaktif işaretleme tekniklerini kullanan Sanger, çeşitli enzimlerin aktif merkezlerinin amino asit sekanslarını ortaya koydu. Bu çalışmalarından birini Arjantin doğumlu immünolog César Milstein adlı öğrencisiyle yaptı. Milstein, monoklonal antikorların üretim ilkesini buluşuyla 1984 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü’nü kazandı.

RNA Dizileme Çalışmaları

1962 yılında, Tıbbi Araştırma Konseyi Cambridge’de yeni bir moleküler biyoloji laboratuvarı açtı. Avusturyalı biyokimyacı Max Perutz, İngiliz biyokimyacı John Kendrew ve İngiliz biyofizikçi Francis Crick bu yeni laboratuvarda çalışmaya başladılar. Frederick Sanger de, protein bölümünün başına getirildi. 1962 yılı laboratuvarın dünya çapında tanındığı bir yıl oldu. Perutz ve Kendrew 1962 Nobel Kimya Ödülü’nü paylaşırken, Francis Crick, DNA’nın keşfiyle, Amerikalı genetikçi James D. Watson ve Yeni Zelandalı biyofizikçi Maurice Wilkins’le birlikte 1962 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü’nü paylaştı.

Sanger’in yeni laboratuvarda yaptığı nükleik asit çalışmaları, ribonükleik asit (RNA) konusundaki araştırmalara yöneldi. RNA molekülleri proteinlerden çok daha büyüktü, bu nedenle de teknik geliştirmeler için yeterli küçüklükte moleküller elde etmek zordu. Amerikalı biyokimyacı Robert W. Holley ve çalışma arkadaşları, alanin – transfer RNA’sının dizilemesini gerçekleştirirken Sanger’in insülin için kullandığı kısmi hidroliz yöntemlerinden yararlanmışlardı. Diğer RNA tiplerinden farklı olarak, transfer RNA’larının çok sayıda olağan dışı nükleotidi olması, ancak kısmi hidroliz metodunun yalnızca dört tip nükleotid içeren diğer RNA molekülleriyle iyi sonuç vermemesi nedeniyle yeni bir stratejiye ihtiyaç duyulmaktaydı.

Frederick Sanger’in laboratuvarının amacı, bir mesajcı – RNA dizilemesini gerçekleştirmek ve genetik kodu belirlemek, böylece nükleotid gruplarının amino asitleri nasıl kodladıkları hakkındaki bulmacayı çözmekti. Sanger, İngiliz biyokimyacılar George G. Brownlee ve Bart G. Barrell ile birlikte, RNA’nın sekanslanması için iki boyutlu bir elektroforez yöntemi geliştirdi. Dizileme metotları kullanılmaya başlandığında, başka araştırmacılar, özellikle de Amerikalı biyokimyacı Marshall Nirenberg ve Hindistanlı biyokimyacı Har Gobind Khorana, in vitro protein sentez tekniklerini kullanarak kodu kırmışlardı. Sanger’in ekibinin RNA dizisi çalışması, bu genetik kodu doğruladı.

DNA Dizileme Çalışmaları

Sanger, 1970’li yılların başında, deoksiribonükleik asitle (DNA) ilgilenmeye başladı. DNA dizisi çalışmaları, DNA moleküllerinin muazzam büyüklüğü ve DNA’yı küçük parçalara bölmek için uygun enzimlerin bulunmaması nedeniyle gelişmemişti. Araştırmalarını, İsviçreli kimyacı Charles Weissmann’ın bakteriyofaj RNA’sıyla ilgili çalışmalarında kullandığı enzim kopyalama yaklaşımı üzerine temellendiren Sanger, DNA dizilemesini tek şeritli şablonlardan yararlanarak yapmak için DNA polimeraz enzimini kullanmaya başladı ve yeni DNA’ya radyoaktif nükleotidler ekledi.

DNA polimeraz, şablon zincirinin belirli bir bölgesine bağlanabilen bir primer gerektirmekteydi. Başarı, uygun primerlerin eksikliği ile sınırlıydı. Sanger ve İngiliz meslektaşı Alan R. Coulson, hızlı bir DNA dizilemesi için “artı ve eksi” yöntemini geliştirdiler. Yöntem, kısmi hidrolizden yararlanmadığı için daha önceki yöntemlerden radikal bir farklılık gösteriyordu. Poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak ayrılabilen çeşitli uzunluklarda bir dizi DNA molekülü üretmekteydi. Şablonlardan, hem artı hem de eksi sistemler için, çok kısadan çok uzuna, DNA random molekül kümeleri oluşturmak için sentezlendi. Hem artı hem de eksi setleri aynı jelde ayrıldığında, sekans biri diğerini onaylayacak biçimde her iki sistemden de okunabiliyordu. 1977 yılında, Frederick Sanger’in çalışma grubu, dizilemesi çözümlenen ilk tam genom olan bakteriyofaj DNA dizisi için bu sistemi kullandı.

Artı ve eksi sistemlerle ilgili çözülememiş bir kaç problem kalmıştı. Frederick Sanger, Alan R. Coulson ve İngiliz meslektaşı Steve Nicklen, dideoksi nükleotid zincir – sonlandırıcı inhibitörleri kullanan bir prosedür geliştirdiler. DNA, büyüyen DNA zincirine bir inhibitör molekül eklenene kadar sentezlendi. Her biri farklı bir inhibitöre sahip dört reaksiyon kullanılarak, her nükleotidde DNA fragmanları oluşturuldu. Örneğin, A reaksiyonunda, A (adenin) ile biten bir dizi DNA fragmanı üretildi. C reaksiyonunda, C (sitozin) ile biten bir dizi DNA fragmanı üretildi, G (guanin) ve T (timin) için de aynı işlem gerçekleştirildi. Dört reaksiyon bir jel üzerinde yan yana ayrıldığında ve bir otoradyografi elde edildiğinde, dizileme film üzerinde okunabiliyordu. Frederick Sanger ve çalışma arkadaşları, insan mitokondriyal DNA’sını dizilemek için de dideoksi yöntemini kullandılar. Böylece, Frederick Sanger DNA dizileme metotlarına yaptığı büyük katkılardan dolayı 1980 Nobel Kimya Ödülü’nü de kazandı ve 1983’te emekli oldu. Wellcome Trust ve Tıbbi Araştırma Konseyi, bu büyük bilim insanının onuruna “Sanger Merkezi”ni (şimdi Sanger Enstitüsü) kurdu. Merkez, Sanger’in de katılımıyla, 4 Ekim 1993 tarihinde yaklaşık elli bilim insanından oluşan bir kadroyla açıldı ve insan genomu araştırmalarında lider bir rol üstlendi. Günümüzde, Sanger Enstitüsü 900’den fazla araştırmacının birlikte çalıştığı dünyanın en büyük genomik araştırma merkezlerinden biridir.

Kaynakça:
– George G. Brownlee, “Fred Sanger, double Nobel laureate: a biography”, Cambridge University Press, (2014).
– Miguel García-Sancho, “A new insight into Sanger’s development of sequencing: from proteins to DNA, 1943-1977”, Journal of the History of Biology, 43, (2010).
– Lara Marks, “The path to DNA sequencing: The life and work of Fred Sanger”, What is Biotechnology, (2015).

Yazar: Oben Güney Saraçoğlu