Bilgiustam
Türkiye'nin Bilgi Sitesi

Gen Nakavtı Yöntemi

0 36

Gen nakavtı; bir geni çıkararak, hücre veya organizma üzerindeki etkileri gözlemleyerek genlerin işlevini incelemek için kullanılan moleküler biyoloji yöntemidir. Geni tamamen silerek, gene mutasyonlar sokarak, genin ekspresyonunu baskılayarak veya olgun organizmada geni düzenleyerek başarılabilir.

Gen Nakavt Yöntemleri

Yapay gen nakavt organizmasını oluşturmak için, ilgilenilen geni susturmak veya çıkarmak için birkaç yöntem kullanılır. Gen nakavt yöntemleri şunlardır:
• Gen susturma
• Koşullu nakavt
• Homolog rekombinasyon
• Gen sonu
• Mutasyona göre nakavt

Mutasyon ile Gen Nakavt

Mutasyon yoluyla gen nakavt genellikle bakterilerde gerçekleştirilir. Bu tekniğin Escherichia coli’de kullanılmasının erken bir örneği 1989 yılında Hamilton ve arkadaşları tarafından uygulanmıştır. Bu deneyde, geni silmek için iki ardışık rekombinasyon kullanılmıştır. Bu çalışma, bakterilerdeki fonksiyonel bir genin çıkarılması veya değiştirilmesinin fizibilitesini oluşturmuştur. Bu yöntem o zamandan beri diğer organizmalar, özellikle de fareler gibi araştırma hayvanları için geliştirilmiştir.
Nakavt fareleri, hastalık için önemi olabilecek insan eşdeğerlerine sahip genleri incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Nakavt fareleri kullanan bir araştırmanın son örneği, Ani Açıklanamayan Gece Ölüm Sendromunda (SUNDS) Xirp proteinlerinin ve Çin Han Popülasyonunda Cheng ve arkadaşlarının Brugada Sendromundaki rollerinin araştırılmasıdır .
Araştırmacılar, iki sendromlu kişilerde Xirp genlerini taradılar ve patojenik olabilecek iki gen varyantı belirlediler. Xirp2 nakavt fareleri kullanarak, Xirp2 içermeyen fare kalplerinin bir takım anormalliklere sahip olduğunu öğrenmişlerdir. Bu çalışma, SUNDS ve Brugada sendromunda rol oynama olasılığı bulunan Xirp varyantlarının tanımlanmasına ve Xirp2’nin kalp fonksiyonundaki rolünü ortaya koymasına izin vermiştir.

Gen Susturma

Gen susturma veya RNA etkileşimi (RNAi), gen nakavt çalışmaları için popüler hale gelen daha yeni bir teknolojidir. RNAi’de, belirli bir gen için haberci RNA’yı inaktive etmek için küçük karışan RNA (siRNA) veya kısa saç tokası RNA (shRNA) kullanılmaktadır. Bu, gen ekspresyonunu etkili bir şekilde bastırır. RNAi kullanılarak gen susturulması, Bcl-2 ve p53 gibi onkogenlerin yanı sıra nörolojik hastalık, kalıtsal bozukluklar ve viral enfeksiyonlarda yer alan genleri hedeflemek için kullanılmıştır.

Koşullu Nakavt

Gen silinmesini kullanan nakavt yöntemleri, erken gelişimde yer almayan genleri incelemek için güçlü olmuştur. Bununla birlikte, erken gelişim sırasında aktif olan genler, organizmaya öldürücü bir etki olmaksızın genellikle elenemez. Koşullu nakavt bunun üstesinden gelmenin bir yoludur. Orijinal koşullu nakavt yöntemi, LoxP olarak bilinen kısa hedef sekansları yeniden birleştiren Cre adı verilen bölgeye özgü bir rekombinaz kullandı. O zamandan beri başka rekombinazlar geliştirildi ve şartlı nakavt çalışmaları için kullanılmıştır.
Önceki yöntemlerden ikisini birleştiren Kuhn, et al RNA’sının (shRNA) ekspresyonunu kontrol etmek için Cre rekombinaz veya doksisiklin kullanılarak farelerde gen susturulmasının indüklenmesi için bir 2010 makalesinde bir yöntemi tarif eder. Yöntem, demonte farelerin tekrarlanabilir üretimi ile sonuçlanmıştır.

Gen Düzenleme

Çinko parmak nükleazları (ZFN’ler), transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazlar (TALEN’ler) ve düzenli aralıklarla kümelenmiş kısa palindromik tekrar (CRISPR) gibi gen düzenleme sistemleri, bölgeye özgü rekombinazlara karşı ortaya çıkan bir alternatiftir. Bu enzimler, klonlama gibi moleküler biyolojide birçok temel yöntemin yerini almaya başlamıştır. Koşullu gen nakavt, orijinal araçlara göre bazı avantajlara sahip oldukları başka bir örnektir.

Gen Nakavt Süreci

Gen nakavt yönteminde bazı süreçleri takip edilmesi gerekir. Bu süreçler şu şekildedir:
Nakavt için bir gen seçme: Genetik mühendisliği deneylerinin herhangi birindeki ilk adım, hedefi seçmektir, burada hedef, çalışmak veya işlevini anlamak istenilen bir gendir. Bundan sonra, ilgilenilen genle ilgili yapı, uzunluk ve diğer parametrelerin çalışıldığı bazı kuru laboratuvar çalışmaları yapılır. Buna dayanarak, deney için en uygun plazmid seçilir. Ancak bundan önce, ilgilenilen gen tanımlanır ve bir kromozom üzerinde haritalanır.
Vektör yapımı: Vektör, ilgilenilen gen veya başka herhangi bir DNA dizisini hedef hücrelere transfer etmek için kullanılan bir araçtır, bunun için genellikle bir plazmid kullanılır. Plazmid, genetik mühendisliği deneyleri için kullanılan bir bakterinin kromozom dışı DNA’sıdır. BAC- bakteriyel yapay kromozom vektörü, gen nakavt deneyleri için kullanılır. DNA dizisine, protein oluşumunu engelleyen bir çerçeve kayması mutasyonu eklendiği varsayalım.
Bazı ORF’ler yani açık okuma çerçevelerini genden çıkarılması ve değiştirilmiş bir geni BAC’ye yerleştirilmesi işlemidir. Bu şekilde daha güvenli bir şekilde, sonuçları doğrulamak için bir işaretçi DNA dizisi de eklenir, genellikle bunun için bir antibiyotik direnç geni kullanılır. Bununla birlikte, replikasyonun orijini, promoter sekansı ve tanıma sekansları gibi diğer önemli DNA sekanslarından bazıları da plazmide eklenir. Artık plazmidi dönüşüme hazırdır.

ES hücrelerine yerleştirme: Şimdi elektroporasyon, sonikasyon veya mikroenjeksiyon gibi yapay yöntemler kullanarak, plazmidi ES hücrelerine yerleştirilir. Embriyonik kök hücreler daha hızlı bölünebilir ve her tür hücreye bölünebilir. ES hücreleri, olgun fare dokularına dönüşme gücüne sahiptir. Elektroforasyon yöntemi, elektrik akımı altında hücreye bir genin yerleştirildiği bilim adamları tarafından gen nakavtında kullanılan en iyi tekniklerden biridir ve artık e ES hücreleri plazmidi hedef hücreleriniçindedir.
Hedef geni bulursa, rekombinasyon meydana gelir ve hedef gene bir mutasyon eklenir. Ayrıca bir işaretleyici gen dizisi kullanılır, böylece mutant gen dizisi ile birlikte, işaretleyici gen dizisi de dönüştürülmüş hücrelerin genomuna eklenir. Şimdi dönüştürülmüş hücrelee neomisin içeren ortama büyütülüyor, böylece NeoR genini içeren hücreler büyüyebiliyor. Ve NeoR içeren hücreler ile NeoR geni olmayan hücreler arasında ayrım yapılabilir.
Ek parçanın onaylanması: Hücreler in vitro koşullar altında büyüttütüldüğünde, bazı hücrelerin dönüştürülmesi veya bazı hücrelerin dönüştürülmemesi mümkündür. Şimdi, polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak, ek doğrulanabilir. Bunun için DNA, kültürlenmiş hücrelerden ekstrakte edilir. İşaretleyici DNA dizisine özgü bir dizi primer, amplifikasyonun başarılması için kullanılır. Amplikonlar gözlenirse hücreler dönüştürülür, aksi takdirde deneyimiz başarısız olur. ES hücrelerinin başarılı bir şekilde dönüştürüldüğünü varsayıldığında, buna genetiği değiştirilmiş hücreler denilebilir.
Embriyoya enjekte etmek: Dönüştürülmüş hücreleri seçilir ve onları model organizmanın gelişmekte olan embriyosuna yerleştirilir. Normal şekilde büyümesine izin verilir.
Model fare seçimi: Model organizmanın embriyosunda iki tür hücre popülasyonu vardır, biri vahşi tip ve diğeri değiştirilmiş (dönüştürülmüş) hücreler, bu hayvana kimerik denir. Kimerik hayvan genetik olarak değiştirilmiş durumdadır, bir sonraki adımda, onu iki farklı genotipin yavrularını üreten normal hayvanla çiftleştirilir ve biri homozigot normal veya homozigot değiştirilmiş genotipe sahip başka bir hayvan (ve aynı zamanda heterozigot) elde edilir.
Sonuç: Artık gen nakavt hayvanı inşa edilmiş durumdadır ve bilim adamları onu ilgilenilen genle ilgili farklı parametreleri ölçmek için inceleyebilirler. Genle ilgili fiziksel, biyokimyasal veya genetik parametreler incelenebilir. Bundan sonra, PCR amplifikasyon yöntemi kullanılarak, gen nakavtının sonuçları doğrulanabilir.

Gen Nakavtı Nasıl Doğrulanır?

Gen nakavtının doğrulanması, tüm deneyin çok önemli bir parçasıdır. Bunu yapmak için birçok farklı yöntem kullanılsa da, günümüzde popüler yöntemlerden biri, polimeraz zincir reaksiyonudur. Polimeraz zincir reaksiyonu, yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir ve çoğu deney için en güvenilirdir. Burada, gen nakavtını doğrulamak veya onaylamak için iki primer seti kullanılır. Bir primer seti, hedef sekansın komşu bölgelerinden tasarlanır ve diğer primer seti, markör gen sekansı, yani antibiyotik direnç geni için tasarlanır.
Deneyin önemli sonuçlarından biri hedef gen yeniden birleştirilirse, antibiyotik gen hedef genoma aktarılır. Bu nedenle, işaretleyici genin tamamlayıcısı olan primer seti ile PCR reaksiyonunda DNA bandı elde edersek deneyimiz başarılı olur. Diğer yandan, hedef gen çıkarıldıktan sonra, ilgilenilen gene özel kuşatma primerleri çoğaltılamaz ve DNA bandı elde edilemez. Bununla birlikte, bir kontrol reaksiyonu olarak yabani tip DNA kullanılmaktadır, böylece primer seti 1 ile bir DNA bandı elde edilebilir. Amplifikasyon reaksiyonu tamamlandıktan sonra sonuçlar, agaroz jel elektroforezi kullanılarak doğrulanır. PCR’nin sonuçları % 2 agaroz jelde görselleştirilebilir.

Gen Nakavtı İçin Neden Fareler Seçilir?

Bir genin işlevini incelemek için yaratılmış, etkisizleştirilmiş ilgili gene sahip farelere nakavt fareler denir. Fareleri, insan ve fare genleri arasındaki benzerliklerden dolayı genetik mühendisliği çalışmalarında ve nakavt çalışmalarında kullanılmaktadır. İnsan ve fare genlerinin% 99’u benzerdir, bu nedenle deney için insan embriyosunu doğrudan kullanmak yerine fareleri kullanmak akıllıca bir karardır. İnsan embriyo çalışmaları ile ilişkili birkaç etik sorun nedeniyle, bilim adamları fareleri gen nakavt çalışmaları için kullanılmaktadırlar.

Kaynakça:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29306897
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC534783

Yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu

Bunları da beğenebilirsin

Cevap bırakın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak.