Embriyo kültivasyon ortamı genellikle IVF prosedürü sırasında atılır, ancak çoklu teşhis ve prognostik prosedürler için kullanılabilir. Kesinlikle, etik, ahlaki yönergeler ve prosedürlere uyulmalı ve etik kurul veya diğer ilgili kuruluşlar bu materyalin kullanımını onaylamalıdır. Bu konuda yapılan deneyler, Viyana’daki Tıp Üniversitesi ve Avusturya’daki Linz Üniversitesi’nin etik kurullarından onay alınarak IVF ortamından yetiştirme ortamları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Örnekler, embriyo gelişiminin farklı aşamalarında toplandı ve düşük örnek miktarlarının analizi için oluşturulan yöntemler kullanılarak analiz edilmektedir.
Proteomik Numune Hazırlama
Protein sindirimi için tripsin, Promega Inc.’den (Viyana, Avusturya) satın alındı. HPLC için çözücüler – metanol (MeOH), asetonitril (AcN), 2,2,2-trifloroetanol (TFE), formik asit (FA), heptaflorobütirik asit (HFBA), iyodoasetamid (IAA), trietilamonyum bikarbonat (TEAB) ve ditiotreitol —Sigma-Aldrich’ten (Viyana, Avusturya) satın alınmıştır. Embriyo yetiştirme ortamını analiz ederken en önemli adımlardan biri, bu örneklerde bulunan serum albümininin tükenmesidir. Tarasova vd., küçük örnek hacimlerinin tükenmesi için immobilize anti insan albümin antikorlarının kullanılmasına yönelik yenilikçi yöntemi açıkladı. Kısaca, seçilen embriyolardan kültür ortamı örneklerinin tükenmesi için numune, 0.01 M fosfat tamponu, 0.0027 M KCl ve 0.14 M NaCl’den oluşan fosfat tamponlu salin tamponu (pH 7.4) kullanılarak seyreltildi. Bu tampon ayrıca numune yüklemesi üzerine yıkama tamponu A olarak da kullanılmıştır. 
Tükenme kolonundan tam numune geri kazanımını sağlamak için, tampon B olarak Agilent (pH 2.25) (Agilent Technologies, CA, ABD) ‘den kullanıma hazır bir elüsyon tamponu kullanıldı. Tükenmesi için yeni bir kolon geliştirdik. antihuman albümin antikorlarını monolitik destek diskine, özellikle IVF numunelerinde de oluşan küçük numune miktarlarının analizi için CIMac-HSA kolonuna sabitleyerek insan albümini. Bu kolon, 0.3 mL / dakikalık bir kolon akış hızıyla albümin tükenmesi için bir ICS-5000 inert HPLC sisteminde (Dionex-Thermo Scientific, Germering, Almanya) kullanılmıştır. Numune enjeksiyonu üzerine, yükleme ve yıkama tamponu A, 5 dakika boyunca kolondan pompalandı ve akış fraksiyonu toplandı (V = 350 uL). Bu fraksiyonların hacmi, tam absorbans zirvesine karşılık gelir ve kolon üzerinde hapsolmamış tüm proteinleri içerir.
Albümin, kolonun yüzeyindeki antikorlarla etkileşim tarafından tutuldu ve ayrıştırılan mobil fazın miktarı 5’ten 10 dakikaya çıkarılarak ayrıştırıldı. Sütun, son olarak, 4 dakika daha yükleme tamponu A ile yıkandı ve bu aşamayı, tampon B ile ilave bir yıkama aşaması ve son olarak, 13 dakika süreyle yeniden yükleme tamponu A kullanılarak dengeleme aşaması izledi. Bu tükenme protokolünü tamamlamak için toplam süre, 0,3 mL / dak kolon akış hızı uygulanırken 30 dakikadır. Bu süre boyunca, çok önemli kolon yıkama adımı ve bir sonraki tükenme çalışmasından önceki kolonun tamamen yeniden dengelenmesi gerçekleştirilir. Kullanılan akış hızı, proteinin etkileşim süresini maksimize etmek için seçildi ve işlemin hızı ve etkinliği arasında bir uzlaşmaydı. İstenirse, daha yüksek kolon akış hızları, kolonun performansının çoğunu kaybetmeden kullanılabilir.
Kullanılan akış hızı, proteinin etkileşim süresini maksimize etmek için seçildi ve işlemin hızı ve etkinliği arasında bir uzlaşmaydı. İstenirse, daha yüksek kolon akış hızları, kolonun performansından fazla bir şey kaybetmeden kullanılabilir. Kullanılan akış hızı, proteinin etkileşim süresini maksimize etmek için seçildi ve işlemin hızı ve etkinliği arasında bir uzlaşmaydı. İstenirse, daha yüksek kolon akış hızları, kolonun performansından fazla bir şey kaybetmeden kullanılabilir, ancak bu dikkatlice incelenecek ve optimize edilecektir.
Hem toplanan fraksiyonlardaki hem de tükenmemiş örneklerdeki proteinler, tripsin ile standart bir protokol kullanılarak tüketildi. Toplanan fraksiyonlarda yüksek konsantrasyonda fosfat tamponu nedeniyle, 50 mM TEAB nihai konsantrasyonuna ulaşmak ve fosfat tamponunu seyreltmek için fraksiyonlara 1 M trietilamonyum bikarbonat (TEAB) ilave edildi. Protein denatürasyonu için, 50 m MTEAB içinde 10L% 0.1 (w / v) Rapigest tüm fraksiyonlara eklendi ve disülfid bağlarının indirgenmesi, ditiyotreitol (5 mM DTT nihai konsantrasyonu) kullanılarak ve reaksiyon karışımı 30 dakika süreyle 60 ° C’de inkübe edilmiştir.
Başarılı bir tripsinizasyon için, alkilasyon, 15 mM IAA nihai konsantrasyonda iyodoasetamid kullanılarak gerçekleştirildi. IAA ilave edildikten sonra, numune oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edildi. Fazla iyodoasetamid, tripsin etkisini inhibe ediyor ve nötralize edilmesi gerekmektedir; bu, 50 mM TEAB içinde 2 L 50 mM DTT eklenerek ve 2 dakika boyunca oda sıcaklığında kuvvetli bir şekilde karıştırılarak elde edildi. Son olarak, 10L 0.2 g/L tripsin solüsyonu eklenmiş ve numuneler bir inkübasyon fırınında 37 ° C’de 16 saat inkübe edilmiştir. Triptik aktivite, solüsyonun % 1 TFA solüsyonu ile asitleştirilmesiyle durduruldu.
LC – MS / MS analizi için, 20 L sindirilmiş ve seyreltilmiş örnek (2: 3 (v / v) oranında sulu% 0,1 TFA) LC – MS / MS analizi için enjekte edilmiştir.
Kromatografik Ayırma ve Kütle Spektrometresi Algılama
Triptik peptidlerin nanoHPLC ile ayrılması için bir Dionex UltiMate 3000 RSLC nanoLC sistemi (Dionex-Thermo Scientific) kullanılmıştır. Triptik peptidlerin kromatografik ayrılması için kullanılan mobil fazlar aşağıdaki gibiydi: (A) sulu % 0.1 formik asit içinde % 5 asetonitril ve (B) metanol, trifloroetanol, su ve asetonitril (30: 10: 10: 50 (h / h / v / v) ve % 0.1 formik asit). Numune, kalıntı tuzlarının yıkanması ve 3 ° C’ye soğutulmuş% 0.1 sulu TFA’dan oluşan mobil faz yükleme kullanılarak küçük bir numune olarak önden analitlerin odaklanması için tuzak kolonuna yüklenmiştir.
75 dakikalık toplam çalışma süresinin doğrusal olmayan gradyanı, triptik peptitlerin HPLC ayırmaları için kullanıldı. Gradyan, sıralı doğrusal adımlar kullanılarak oluşturulmuştur:
• 7 dakika için % 1.0 B min- 1 .
• 38 dakika için % 0.5 B min- 1 gradyan.
• % 1.5 B min – 1, 20 dak.
• 10 dakika için % 3.0 B min -1
HPLC akışı, maXis Impact UHR TOF kütle spektrometresine (Bruker Daltonics, Bremen, Almanya) dahil edildi ve LC-MS / MS analizi, her numune için üç kez gerçekleştirilmiştir. Peptit parçalanması (MS / MS) için, çarpışmanın neden olduğu ayrışma kullanıldı ve tüm MS / MS verileri, aletin parametrelerinin daha fazla optimizasyonu yapılmadan üç saniyelik bir döngü kullanılarak 300-2000 m / z aralığında elde edildi. Düşük yoğunluklu iyonların gereksiz parçalanmasını önlemek için öncü iyonlar için alt eşik 1000 sayıma ayarlandı.
Bazı peptidlerin kuyruklanması ve sık sık gözlemlenen piklerin birlikte elüsyonu nedeniyle, dinamik bir dışlama kullanıldı ve süre 120 saniyeye ayarlandı. Öncü iyonun 120 saniyelik dışlama süresinden sonra daha yüksek yoğunluk göstermesi durumunda, ilave bir MS / MS olayı için yeniden değerlendirilmiştir.
Protein tanımlaması için veri tabanı araştırması, tüm taksonomi Swiss-Prot veri tabanı kullanılmıştır. Bu arama için X Aşağıdaki parametrelere sahip Tandem kullanılmıştır:
• Öncü kütle toleransı ± 10 ppm’dir.
• ± 0.3 Da’lık parça kütle toleransı.
• Maksimum iki gözden kaçan bölünmeye izin verilmiştir.
Numune hazırlanmasına ve biyolojik süreçlere bağlı olarak peptitlerin bazı posttranslasyonel modifikasyonları beklenebilir. Tarif edilen deney için, sabit modifikasyon ve metiyonin oksidasyonu olarak sistein karbamidometilasyon seçilmiştir. Serin, treonin ve tirosin tortularının fosforilasyonunun yanı sıra lizin ve N-terminal tortularının asetilasyonu, değişken modifikasyonlar olarak seçilmiştir.
Veri Analizi
Açıklanan deneyler için tüm veri analizleri Tarasova ve diğerleri tarafından açıklanan yöntem kullanılarak analiz edilmiştir. Pyteomics.pepxmltk dönüştürücünün kullanımı (ve arama başka bir yerde açıklanmıştır. Kısaca, bu platform X’i dönüştürmek için kullanılmıştır. Tandem dosyaları standart pep.xml formatında ve veri analizi gerçekleştirilmiştir. Veri tabanı araştırması üzerine tüm tanımlamalar, peptit seviyesinde % 1.0 FDR gereksinimini karşılamak için süzüldü. Arama sonuçları, daha önce tarif edilen MPscore yazılımı kullanılarak bir arama sonrası doğrulama için gönderilmiştir.
Belirlenen proteinler ile ilgili kantitatif bilgi, biyolojik numuneler arasında farklılıkları belirlemek için önemli bir gereklilik olduğunu, ve kimlik ve doğrulama gereklerini yerine getiren tüm proteinler normalleştirilmiş spektral indeksi (SIN) olarak adlandırılan etiket içermeyen kantitatif bir yaklaşım (Griffin ve diğ.) kullanılarak nicelleştirilmiştir.
IVF Yetiştirme Ortamında Albümin Tükenmesi
Kültivasyon ortamında albüminin varlığı, embriyoların normal gelişimi için gereklidir. Bununla birlikte, varlığı proteomik analiz için önemli bir yüktür ve ileri analiz adımlarından önce kaldırılması gerekir. Albüminin çıkarılması kapsamlı bir şekilde tartışılmış ve bir dizi yayında açıklanmıştır. Farklı gruplar, bağışıklığı azaltan kromatografi, moleküler ağırlık kesme filtreleri, peptit kitaplıkları, boyut dışlama kromatografisi, vb. Gibi bir dizi yöntem kullanmıştır. Tüm bu yöntemlerin bazı avantajları vardır, ancak aynı zamanda dezavantajları da vardır. Albüminin IVF yetiştirme ortamından tükenmesi durumunda, çok düşük numune hacmi (maksimum 40 l) dikkate alınmalıdır. Ayrıca, hangi döllenmiş oositin önce aktarılacağına ve hangilerinin dondurulacağına karar vermeye yardımcı olacak klinik numunelerin hızlı analizi için kullanılması amaçlanıyorsa, tükenme yöntemi hızlı bir şekilde gerçekleştirilmeli ve çok sayıda numunede tekrarlanabilir olmalıdır.
Bu çalışmada, HSA’nın (CIMac-HSA) tükenmesi için yeni bir immünoafinite tabanlı konvektif etkileşim ortam analitik sütunlarının (CIMac) kullanımı gerçekleştirilmiştir, ve dakika numune miktarlarından hızlı ve tekrarlanabilir albümin tükenmesi için kullanılabileceğini kanıtlamıştır. Kolonun mimarisi ve konvektif akışlı kolonların kanalları akış hızından bağımsız bir bağlama kapasitesi ve mükemmel kromatografik çözünürlük sağlar. Bu özellikler, CIMac-HSA kolonuna, klinik kullanım için olağanüstü önemli bir parametre olan silika bazlı kolonlar kullanılarak albüminin genel kromatografik tükenmesine kıyasla analiz süresinin kısaltılması gibi bazı önemli analitik faydalar sağlar. Yetiştirme ortamının farklı partilerindeki albümin içeriği büyük ölçüde farklılık gösterir ve aynı zamanda farklı tedarikçiler arasında büyük ölçüde farklılık gösterir. Bu nedenle tükenme yöntemi, çeşitli örnekler için uygulanabilecek bir şekilde seçilmelidir.
Seçilen yöntemlerden bağımsız olarak, embriyo transferi üzerine iki ortamın ayrılması için iki SDS-jel şeridini göstermektedir. Albümin farklı donörlerden geldiğinden ve üretim sahasında karıştırıldığından, kesinlikle gelişmekte olan embriyodan salgılanan proteinlere müdahale edebilecek bir dizi başka protein içerecektir. Ayrıca salgılanan proteinler albümine bağlanabilir ve bu nedenle proteomik analiz için görünmez olabilir.
İki farklı tükenme kolonunda kültür ortamı örneklerinde albümin tükenmesi gerçekleştirdikten sonra albüminsiz fraksiyonlarda proteinler ve bunların nispi miktarları tanımlanmıuştır. CIMac-HSA FT’de veya Seppro FT1 fraksiyonlarında tanımlanan proteinler, B ve S ve ardından Swiss-Prot protein ID ile etiketlenir. Normalleştirilmiş spektral indekslerin (SI) medyan değerleri ve standart sapmalar gösterilir. Tükenmemiş örneklerdeki medyan SIHSA kırmızı çizgilerle işaretlenmiştir. Tarasova ve diğerlerine göre listelenen proteinlerin her biri için ikiden fazla peptit-spektrum uyumu varsayılmıştır.
Araştırmacı Dyrlund vd. koşullandırılmamış ticari embriyo kültür ortamının analizini gerçekleştirmiş ve toplam 5 mL ortamın tükenmesi ve sindirilmesi üzerine bir dizi protein tanımlamıştır. Bununla birlikte, gerçek IVF işlemi sırasında örnekler alınırsa 5 mL miktarı hiçbir zaman mevcut olmayacaktır. Bununla birlikte, bu analiz, bu miktarın şaşırtıcı miktarda 25 mg albümin içerdiğini göstermktedir. Burada, albümine ek olarak farklı ortam gruplarında farklı konsantrasyonlara sahip toplam 111 protein tanımlandı. Koşullandırılmamış ortam numunesi ayrıca önceden embriyonik canlılığın olası belirteçleri olarak önerilen sekiz proteini, örneğin proteoglikan-4, serotransferrin, vitamin-D bağlayıcı protein, ubikitin, vb. İçermektedir.
IVF ortamı üzerinde yapılan başka bir çalışma, partiden partiye varyasyonları inceledi ve hem protein miktarlarında hem de protein tanımlamalarında varyasyonun beklenebileceğini göstermektedir. Bu medyayı incelerken, geçerli bir karşılaştırma yapabilmek için hem medyanın, hem de kontrolün hem de embriyoların büyüdüğü medyanın aynı partiden olması gerektiğine dikkat etmek önemlidir.
Kullanılmış IVF ortamı, IVF’de varsayılan biyobelirteçler olarak kullanılabilen proteinler için değerli bir kaynaktır. Araştırmacıların ana odak noktası, salgılanan proteinler olmuştur, ancak ortamda zaten mevcut olan proteinler eşit derecede değerli olabilir ve embriyoların kalitesi biyobelirteçlerinin peşinde düşünülmelidir. Ortamda halihazırda mevcut olan proteinlerin embriyo gelişimi için gerekli olabileceği ve spesifik proteinlerin alımı veya degradasyonu, embriyo gelişimi veya bunun eksikliğinin kesinleşmesi ile ilişkili olabilir. Bu nedenle, bu ortamlar, embriyoların başarı oranlarını ayırt etme ve potansiyel biyobelirteçler olabilecek proteinleri izleme potansiyelleri açısından değerlendirilmelidir. Ek olarak, bu proteinlerin yavrular için kültür ortamındaki güvenliği de değerlendirilmelidir.
IVF Yetiştirme Ortamındaki Proteinlerin Belirlenmesi
Araştırmacılar tarafından tanımlanan proteinler. Katze-Jaff tarafından bireysel olarak kültürlenmiş insan embriyolarının sekretomunun analizi üzerine rapor edilmiştir ve bu proteinlerin embriyonun morfolojisi ve dolayısıyla yaşayabilirliği ile ilişkili olabileceği konusunda bir ipucu yapılmıştır. Dejenere olan blastositlere kıyasla blastositlerin gelişmesinde ubikitinin yukarı regüle edildiğini bildirmişlerdir. Bununla birlikte, ubikitin yukarı regülasyonu ile gözlenen gebelik oranları arasında hiçbir korelasyon yoktur. Cortezzi vd. hem pozitif hem de negatif embriyo gruplarında, yani transfer için canlı olarak adlandırılan ve seçilmeyen embriyolarda proteinlerin tanımlandığını bildirdi. Pozitif implantasyon grubu için Jumonji (JARID2) adı verilen protein bildirildi.
Bu protein, birçok embriyonik modelleme genini susturmak için kromatin metilasyonu modifiye eden ve hücre proliferasyon sinyallemesinin negatif bir düzenleyicisi olarak görev yapan, polikomb baskılayıcı kompleks 2 (PRC2) adı verilen bir histon metiltransferaz kompleksi oluşturur. Bu, hücre kaderlerinin gelişimi, farklılaşması ve sürdürülmesi için gerekli olan uygun bir hücre popülasyonuna sınırlı bir gen ekspresyonu ile sonuçlanır. Aynı çalışmada, testise özgü gen 10 proteini (TSGA10) yalnızca negatif örneklerde tanımlanmıştır. TSGA10, perinükleer bir proteindir ve fare embriyolarında aktif olarak bölünen ve fetal farklılaşan dokulara katıldığı tarif edilmiştir.
Katz-Jaffe vd. heparin bağlayıcı epidermal büyüme faktörü EGF benzeri büyüme faktörü öncülünün (HB-EGF) tanımlanmasını bildirmişlerdir. Bu büyüme faktörü öncüsü, EGF ailesi büyüme faktörlerine aittir ve membrana sabitlenmiş formda (proHB-EGF) ve çözünür formda (sHB-EGF) bulunur. Çözünür form, hücre dışı alanda proHB-EGF’nin proteolitik bölünmesinden üretilir. Ayrıca, çözünür HB-EGF’nin bir büyüme uyarıcısı olduğu gözlemlenmiştir ve serumsuz ortama eklendiğinde blastosist gelişimini ve çıkımını önemli ölçüde iyileştirir. Bununla birlikte, bir in vitro model sistemden yapılan diğer çalışmalar, proHB-EGF’nin büyüme aktivitesini inhibe eden bir jukstakrin mekanizma ile hücreden hücreye sinyallemede işlev görebileceğini göstermektedir. Bu protein dejenere olan blastositlerde tanımlandığından, yukarı regülasyonu daha fazla gelişme olmamasına katkıda bulunabilir.
Maternal uterin epitelinin kontrollü bir trofoblastik istilası için başarılı memeli implantasyonu için sistatin benzeri bir öncü gereklidir. Bu istila çeşitli proteinazlar tarafından uterus matriksinin ekstraselüler degradasyonunu içerdiğinden ve önemli olanlardan biri sistein proteinazlar olduğu için mevcut ve işlevsel olmalıdır. Sistatinlerin, sistein proteinazları inhibe ettiği bilinmektedir ve bunların yukarı regülasyonu, büyük olasılıkla dejenere blastosistlerin implantasyonunun başarısızlığına katkıda bulunacaktır. Bu nedenle, sadece bu proteinleri, olası biyobelirteçleri tanımlamak değil, aynı zamanda bu bulguları insanda doğrulamak da önemlidir.
Kaynakça:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5461434/
http://cms.galenos.com.tr/Uploads/Article_9010/1-8-eng.pdf
Yazar: Özlem Güvenç Ağaoğlu